基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對接方法探討絞股藍(lán)治療非小細(xì)胞肺癌的作用機(jī)制

陳江鋒， 林芝嫻， 韓孫亞， 郭勇

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，浙江杭州 310006）

肺癌是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，每年約有180萬新診斷為肺癌的患者（約占全部癌癥診斷病例的13%），估計死亡人數(shù)接近160萬[1]。非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌的85%，具有高轉(zhuǎn)移率和高復(fù)發(fā)率[2]，大多數(shù)NSCLC患者就診時已處于晚期，手術(shù)不適用，主要治療手段為化療和放療。然而，幾乎所有的放化療都伴有嚴(yán)重的副作用，并且通常會降低患者的生活質(zhì)量。為了提高NSCLC患者的臨床療效，減少副作用，有必要采取新的替代或輔助支持療法。

絞股藍(lán)Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Mak.為葫蘆科絞股藍(lán)屬多年生草質(zhì)藤本植物，又名天堂草、七葉膽、五葉參等，主要分布于中國南部、日本、朝鮮和東南亞等地區(qū)。絞股藍(lán)具有清熱解毒、止咳化痰、補(bǔ)氣生津、健脾安神的功效，被廣泛用于治療咳嗽、哮喘、慢性氣管支氣管炎、傳染性肝炎及勞傷虛損等。此外，絞股藍(lán)還被用于治療肺癌、前列腺癌等，并可與其他中草藥聯(lián)用治療更多不同類型的癌癥[3-4]。現(xiàn)代藥理研究表明，絞股藍(lán)活性成分絞股藍(lán)皂苷damulin A可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻斷G0/G1早期細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞遷移，從而抑制肺癌細(xì)胞的生長[5]。闡明絞股藍(lán)對NSCLC的潛在作用機(jī)制有重要價值。

中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、協(xié)同作用的特點(diǎn)，存在作用機(jī)制及作用成分不清等問題，較難通過傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法系統(tǒng)全面地檢測出中藥的確切作用機(jī)制。因此，有必要探索新方法來闡明中醫(yī)藥的科學(xué)依據(jù)和潛在作用機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)綜合了系統(tǒng)生物學(xué)、組學(xué)和計算生物學(xué)，是一種基于疾病、基因、蛋白靶點(diǎn)、藥物相互作用網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)分析方法，從整體角度揭示了藥物的作用機(jī)制，具有整體性、協(xié)同性和動態(tài)特性[6]，這些特點(diǎn)與中醫(yī)整體理論的特點(diǎn)相一致。此外，分子對接基于網(wǎng)絡(luò)藥理預(yù)測與分析，利用高精度對接模擬和分子通路圖表現(xiàn)配體的選擇性，說明配體如何作用于復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)，從而評估蛋白配體結(jié)合潛力[7]。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對接的方法探討絞股藍(lán)治療NSCLC的作用機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 絞股藍(lán)化學(xué)成分的收集及篩選 從TCMSP數(shù)據(jù)庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）中收集了絞股藍(lán)的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)，選擇同時滿足口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18的成分作為活性成分，然后通過Pubchem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索每一個活性成分的3D結(jié)構(gòu)，剔除未能找到3D結(jié)構(gòu)的活性成分，最后結(jié)果以mol2格式保存。

1.2 活性成分對應(yīng)靶點(diǎn)庫 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫、STITCH數(shù)據(jù)庫（http：//stitch.embl.de/，V4.0）檢索絞股藍(lán)中活性成分靶點(diǎn)，其中，STITCH數(shù)據(jù)庫檢索條件物種設(shè)置為“Homo sapiens”，且置信度大于0.4，剔除沒有相關(guān)信息的活性成分。將靶點(diǎn)輸入到UniProt數(shù)據(jù)庫（http：//stitch.embl.de），所選物種為“Homo sapiens”。剔除重復(fù)、非人和非標(biāo)準(zhǔn)靶點(diǎn)，通過檢索和轉(zhuǎn)化，最終得到絞股藍(lán)活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)庫。

1.3 NSCLC相關(guān)靶點(diǎn)庫的構(gòu)建 以“non-smallcelllungcancer”或“NSCLC”為關(guān)鍵詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org）、OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org）和 TTD 數(shù) 據(jù) 庫（https：//db.idrblab.org/ttd/）中檢索收集與NSCLC相關(guān)的靶點(diǎn)基因，去除重復(fù)基因，得到NSCLC相關(guān)靶點(diǎn)庫。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 為了進(jìn)一步了解絞股藍(lán)作用靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)在蛋白水平上的作用機(jī)制，本研究將兩者篩選得到的相關(guān)靶點(diǎn)庫輸入到Venny 2.1軟件（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）以繪制Venny圖，得到藥物活性成分與NSCLC的交集靶點(diǎn)。再將其輸入在線網(wǎng)站STRING 10.5（https：//string-db.org），蛋白類型設(shè)置為“Homo sapiens”，選取0.7的高置信度，其他參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值，獲取蛋白相互作用的關(guān)系。將導(dǎo)出文件中的node1、node2和combined score導(dǎo)入到Cytoscape軟件中，繪制交互網(wǎng)絡(luò)。設(shè)置節(jié)點(diǎn)大小以反映度值，邊的粗細(xì)來反映combined score的大小，得到最終的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（proteinprotein interaction，PPI）。

1.5 分子對接 選擇PPI中度值靠前的靶點(diǎn)蛋白，從RCSB蛋白數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）中獲得上述靶蛋白的蛋白配體復(fù)合物，采用Systems Dock Web Site（http：//systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index）對其與絞股藍(lán)活性成分進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，評價絞股藍(lán)活性成分與靶點(diǎn)之間的結(jié)合活性，并且篩選出潛在的核心化合物。

1.6 基因本體論（GO）生物過程和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 將絞股藍(lán)的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/），限定物種為人，進(jìn)行GO和KEGG通路分析，設(shè)定閾值P＜0.05，篩選排名靠前的生物過程或通路，利用Omishare Tools（http：//www.omicshare.com/tools/index.php/）對結(jié)果進(jìn)行可視化。在KEGG數(shù)據(jù)庫（https：//www.kegg.jp/）中搜索相關(guān)通路，聯(lián)合Reactome數(shù)據(jù)庫（https：//reactome.org/）加以注釋，整合得到最終的通路圖。

2 結(jié)果

2.1 絞股藍(lán)活性成分的篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18篩選到24種化學(xué)成分，在Pubchem數(shù)據(jù)庫中剔除未能找到3D結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分，在STITCH數(shù)據(jù)庫中選擇置信度＞0.7，剔除不含相關(guān)信息的化學(xué)成分后，最終篩選得到絞股藍(lán)活性成分共8個，具體信息見表1。

2.2 活性成分對應(yīng)靶點(diǎn)庫和NSCLC相關(guān)靶點(diǎn)庫的構(gòu)建 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫、STITCH數(shù)據(jù)庫檢索絞股藍(lán)中活性成分靶點(diǎn)，在UniProt數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，最終得到共84個對應(yīng)靶點(diǎn)。通過檢索GeneCards、OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫，刪去重復(fù)靶點(diǎn)，共得到4 858個NSCLC相關(guān)作用靶點(diǎn)。

表1 絞股藍(lán)中活性化合物的基本信息Table 1 Basic information of active compounds in Herba Gynostemmae Pentaphylli

2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Venny 2.1軟件將上述活性成分對應(yīng)靶點(diǎn)及NSCLC相關(guān)作用靶點(diǎn)進(jìn)行交互處理，得到交集靶點(diǎn)相關(guān)的Venny圖（見圖1）。將交集靶點(diǎn)輸入String數(shù)據(jù)庫中，限定物種為人，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件得到靶點(diǎn)之間相互作用網(wǎng)絡(luò)（見圖2）。在圖2中，節(jié)點(diǎn)代表蛋白，邊代表蛋白之間的相關(guān)性。結(jié)果共涉及64個節(jié)點(diǎn)和249條邊（RUNX1T1、HK2、ACHE、PRSS1、ACACA、PTGER3、EIF6因蛋白之間相關(guān)性較弱在圖中未顯示）。節(jié)點(diǎn)的大小表示度值的大小。節(jié)點(diǎn)越大，對應(yīng)的度值越大。邊的粗細(xì)和combined score相關(guān)，邊越粗，combined score的值越大。其中，度值前4的蛋白分別為表皮生長因子受體（EGFR）（23）、細(xì)胞周期蛋白D1（CCND1）（22）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）（21）和雌激素受體1（ESR1）（21）。

圖1 絞股藍(lán)作用靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的Venny圖Figure 1 Venny diagram of Herba Gynostemmae Pentaphylli action targets and disease targets

圖2 絞股藍(lán)靶蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)Figure 2 PPI network of Herba Gynostemmae Pentaphylli target proteins

2.4 分子對接 在PPI分析中，度值越大意味著該節(jié)點(diǎn)在整個網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)重要地位。本研究選取上述度值前4位的蛋白與絞股藍(lán)活性成分進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，結(jié)果詳見表2。一般認(rèn)為docking score值＞7.0表明活性成分與靶點(diǎn)具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性，＞5.0表明兩者有較好的結(jié)合活性，＞4.25表明有一定的結(jié)合活性[8]。分子對接結(jié)果表明，絞股藍(lán)的活性成分與NSCLC相關(guān)靶點(diǎn)的結(jié)合性較好。制定2個篩選潛在核心化合物的標(biāo)準(zhǔn)：（1）與4個靶點(diǎn)對接，其中對接得分最高的化合物分別為：槲皮素（quercetin）（與VEGFA）、菠菜甾醇（spinasterol）（與CCND1）、谷甾醇（sitosterol）（與EGFR）、膽甾醇（CLR）（與ESR1）。將上述5對靶點(diǎn)化合物放入PyMOL軟件中進(jìn)行優(yōu)化，具體對接蛋白與配體的相互作用如圖3所示；（2）與4個重要靶點(diǎn)對接得分均＞5的化合物，滿足這2個條件的化合物谷甾醇、菠菜甾醇、膽甾醇被認(rèn)為可能是潛在的核心化合物。

表2 絞股藍(lán)4個重要靶點(diǎn)的分子對接Table 2 Molecular docking of four important targets of Herba Gynostemmae Pentaphylli

2.5 GO和KEGG通路富集分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫對上述交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析（見圖4）和KEGG分析（見圖5）。通過GO功能富集分析得到GO條目2 265個（P＜0.05），其中：生物過程（BP）條目1 921個，涉及細(xì)胞過程、代謝過程、生物調(diào)節(jié)、應(yīng)激反應(yīng)等方面；分子功能（CC）條目121個，涉及細(xì)胞組分、細(xì)胞、細(xì)胞器等方面；細(xì)胞組成（MF）相關(guān)的條目223個，涉及結(jié)合活性、催化活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性、分子功能調(diào)節(jié)等方面。通過KEGG通路分析（P＜0.05），排除廣泛通路后，前20條信號通路如表3所示，主要涉及磷脂酰肌醇-3-羥激酶（PI3K）—蘇氨酸激酶（Akt）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、雌激素（Estrogen）信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、低氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）信號通路等，提示絞股藍(lán)治療NSCLC的作用途徑是多種多樣的，這些通路之間存在著復(fù)雜的相互作用。在KEGG數(shù)據(jù)庫中搜索前5條信號通路，聯(lián)合Reactome數(shù)據(jù)庫加以注釋，整合得到最終的通路圖（見圖6）。

圖3 絞股藍(lán)4個重要靶點(diǎn)的對接分析Figure 3 Four important targets of Herba Gynostemmae Pentaphylli Docking analysis

圖4 絞股藍(lán)治療NSCLC作用靶點(diǎn)的GO生物功能分析Figure 4 GO Biological function analysis of potential targets of Herba Gynostemmae Pentaphylli treatment for NSCLC

圖5 絞股藍(lán)治療NSCLC作用靶點(diǎn)的KEGG富集氣泡圖Figure 5 Bubble diagram of KEGG enrichment of potential targets of Herba Gynostemmae Pentaphylli treatment for NSCLC

表3 絞股藍(lán)治療NSCLC作用靶點(diǎn)的KEGG通路分析Table 3 KEGG pathways analysis of potential targets of Herba Gynostemmae Pentaphylli treatment for NSCLC

圖6 絞股藍(lán)治療NSCLC的潛在作用機(jī)制Figure 6 Potential mechanisms of Herba Gynostemmae Pentaphylli treatment for NSCLC

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）屬于“肺積”“肺巖”等范疇，正氣虛損、痰瘀毒互結(jié)是其重要的病機(jī)。絞股藍(lán)具有益氣健脾、清熱解毒、止咳化痰的功效，與NSCLC的病機(jī)相契合，既能清其毒化其痰，又能補(bǔ)其虛。然而，絞股藍(lán)治療NSCLC的具體作用機(jī)制至今仍未完全明確。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對接的方法探討了絞股藍(lán)治療NSCLC的作用機(jī)制。在PPI中，EGFR、CCND1、VEGFA和ESR1的節(jié)點(diǎn)較大，推測這些節(jié)點(diǎn)可能是治療NSCLC的主要靶點(diǎn)。EGFR是一種酪氨酸激酶受體，在細(xì)胞增殖、存活、遷移和凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用，已被發(fā)現(xiàn)是參與NSCLC發(fā)生、發(fā)展的重要致癌因子，在亞洲患者中最為常見。EGFR在大多數(shù)NSCLC患者中過表達(dá)，是治療的重要靶點(diǎn)[9-10]。CCND1是一種重要的致癌基因，通過促進(jìn)細(xì)胞生長、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）從而抑制包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞凋亡，具有很強(qiáng)的致癌能力[11-13]。腫瘤的生長伴隨著血管生成的刺激，VEGF家族在腫瘤血管生成中起著重要作用，而VEGFA在其中起著主導(dǎo)作用[14]。VEGFA是目前發(fā)現(xiàn)的最有效的血管生成刺激因子之一，影響內(nèi)皮細(xì)胞的血管通透性、增殖和活力，并被證明可以促進(jìn)肺癌的進(jìn)展[15-16]。ESR1定位于染色體6p25，屬于轉(zhuǎn)錄激活因子超家族[17]。ESR1被證明具有抑制生長的功能。ESR1啟動子高甲基化已被證明與許多癌癥中基因轉(zhuǎn)錄的不可逆抑制相關(guān)，包括結(jié)腸癌、乳腺癌、頸癌和血液系統(tǒng)腫瘤[18-20]。最近，在肺癌細(xì)胞系以及肺癌標(biāo)本中報道了ESR1的高甲基化[21]，并且有研究表明ESR1表達(dá)的缺失與肺癌中異常的5’CpG島高甲基化有關(guān)[17]。

通過分子對接分析發(fā)現(xiàn)在8種絞股藍(lán)活性成分中，谷甾醇、菠菜甾醇、膽甾醇可能是潛在的核心化合物。有研究表明谷甾醇具有抗腫瘤潛力，能夠誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞G0/G1細(xì)胞周期停滯從而抑制細(xì)胞增殖，抑制NSCLC異種移植腫瘤的生長，因此谷甾醇被認(rèn)為是治療NSCLC的新目標(biāo)[22-23]。此外，菠菜甾醇在小鼠實(shí)驗(yàn)中顯示出了抗腫瘤的潛力，它被發(fā)現(xiàn)對宮頸癌細(xì)胞株HeLa和RAW 264.7具有抗增殖活性[24-25]。另外，有研究表明膽甾醇的消耗增加了吉非替尼的敏感性，靶向膽甾醇與EGFR-酪氨酸激酶抑制劑（TKI）結(jié)合可能成為吉非替尼耐藥的NSCLC的新型治療策略[26-27]。在3種潛在核心化合物中，菠菜甾醇對NSCLC的治療尚未見報道，這可能是菠菜甾醇與NSCLC的相關(guān)性還尚未被研究，這為進(jìn)一步研究絞股藍(lán)治療NSCLC的機(jī)制提供了理論參考。

DAVID通路注釋分析結(jié)果顯示，絞股藍(lán)治療NSCLC的潛在作用機(jī)制多集中在細(xì)胞增殖和抗炎作用。排名前5位的信號通路分別為PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、Estrogen信號通路、TNF信號通路和HIF-1信號通路。與細(xì)胞增殖相關(guān)的信號通路有PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、Estrogen信號通路、HIF-1信號通路等；與炎癥反應(yīng)相關(guān)的信號通路包括PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、TNF信號通路等。PI3K-Akt是最重要的信號傳導(dǎo)通路之一，參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡等相關(guān)病理生理過程[28]。PI3K-Akt通路的失衡在肺癌的形成和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，其通路的激活可以激活多個下游信號的傳導(dǎo)，促進(jìn)NSCLC的發(fā)展[29]。因此，抑制PI3K-Akt信號通路的傳導(dǎo)對NSCLC的治療至關(guān)重要。MAPK調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號通路，參與細(xì)胞生長、發(fā)育、分裂及細(xì)胞間的功能同步等多種生理過程與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化等病理過程，在NSCLC中扮演著重要角色[30]。MAPK的主要成分包括3個亞家族：生長因子反應(yīng)通路，包括ERK1/2；2條應(yīng)激反應(yīng)通路，包括JNK/SAPK和p38MAPK。研究顯示，ERK在NSCLC組織中異常表達(dá)或活性增強(qiáng)，表明ERK調(diào)控異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[31-32]；JNK通路主要在細(xì)胞增殖、凋亡及應(yīng)激等多種生理病理過程中起重要作用[33-34]；p38被證實(shí)能夠促進(jìn)肺癌的發(fā)生、發(fā)展[35]。Estrogen已被證實(shí)具有增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞惡性程度、刺激腫瘤細(xì)胞生長的作用[36-37]。它的生物學(xué)作用是通過2種雌激素受體（ESR）α和ESRβ來實(shí)現(xiàn)的[38]，其受體廣泛存在于乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、肺癌及正常肺組織中，可以調(diào)控細(xì)胞周期、控制細(xì)胞信號傳導(dǎo)和影響細(xì)胞生存。目前普遍認(rèn)為Estrogen及其受體系統(tǒng)與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展具有一定的相關(guān)性[39]，Estrogen通路在NSCLC治療中有著重要意義。TNF是一種直接殺傷腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞因子，對正常細(xì)胞無明顯毒性，它是目前發(fā)現(xiàn)殺死腫瘤的最活躍的生物活性因子之一。它通過與細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞生長、分化、凋亡和誘導(dǎo)炎癥[40]。TNF主要分為TNF-α和TNF-β。TNF-α是一種多效細(xì)胞因子，其與TNF受體相互作用，導(dǎo)致核因子κB（NF-κB）的立即激活和隨后的細(xì)胞凋亡，TNF-α在細(xì)胞存活、細(xì)胞凋亡和炎癥中扮演了重要的角色[41]。HIF-1是缺氧誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活因子，是氧穩(wěn)態(tài)和生理反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子[42]。HIF-1通過對血管重構(gòu)和血管生成的影響來調(diào)節(jié)氧氣的輸送，并通過參與氧化還原穩(wěn)態(tài)和葡萄糖代謝來調(diào)節(jié)氧的利用[43]。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)就由HIF-1α誘導(dǎo)，是血管生成最特異、最關(guān)鍵的調(diào)控因子之一，能夠調(diào)節(jié)血管生成和血管通透性，在NSCLC的組織重塑和血管生成中發(fā)揮著重要作用[44-45]。因此，HIF-1信號通路可能與NSCLC的進(jìn)展相關(guān)。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法闡明絞股藍(lán)可通過多化合物、多靶點(diǎn)、多通路作用于NSCLC。然而本研究基于數(shù)據(jù)分析對揭示其藥理作用機(jī)制僅提供了理論參考，故仍需要通過進(jìn)一步的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證我們的發(fā)現(xiàn)。