川西高原早熟玉米種質(zhì)資源的SSR 遺傳多樣性分析

楊榮志 譚 君 楊華勇 吳 鋼 余康進(jìn) 楊俊品

（1 阿壩州農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究所，四川馬爾康 624000；2 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，成都 610000）

玉米是我國主要的糧飼兼用作物，尤其是在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)條件較差的高原地區(qū)和高寒山區(qū)，玉米生產(chǎn)在糧食穩(wěn)定中的地位更加突出。中緯度高原地區(qū)由于特殊的地理?xiàng)l件和人們對飲食的需求，需要生育期短、品質(zhì)優(yōu)的玉米品種；傳統(tǒng)選育在材料上具有較強(qiáng)的獨(dú)立性，外來資源少，對本地區(qū)地方種質(zhì)資源的依賴性較大，但長期以來較為單一的雜交模式給玉米育種工作的突破帶來了難度[1-2]。

近年來，隨著現(xiàn)代分子標(biāo)記技術(shù)在農(nóng)作物研究中的成熟應(yīng)用，各地利用分子標(biāo)記技術(shù)研究玉米種質(zhì)資源遺傳多樣性的報(bào)道很多[3-4]，但中緯度高原地區(qū)中早熟玉米種質(zhì)資源作為特殊的遺傳類型，分子水平研究報(bào)道較少[5]。本研究利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)，對27 份川西高原傳統(tǒng)利用和新近育成的中早熟玉米自交系以及5 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)測驗(yàn)種進(jìn)行研究，分析種質(zhì)資源間的遺傳關(guān)系，在此基礎(chǔ)上建立雜種優(yōu)勢群，為這一地區(qū)今后的玉米育種工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料供試材料包括川西高海拔地方種質(zhì)的自交系或地方種質(zhì)改良自交系9 份，外來血緣選育的中早熟自交系13 份，引進(jìn)中早熟自交系5 份，以及我國主要玉米雜優(yōu)模式群體代表自交系5 份（表1）。

1.2 試驗(yàn)方法試驗(yàn)于2016 年進(jìn)行。在玉米1～2 葉幼苗期剪取莖葉，采用國際水稻研究所提出的CTAB法提取DNA。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)及產(chǎn)物檢測：反應(yīng)體系15μL，其中含1×Buffer，2.5mmol/L MgCl2，0.4mmol/L dNTP，SSR 引物（前引物和后引物）各3.3ng/μL，0.5U Taq DNA 聚合酶，70ng DNA 模板。反應(yīng)程序采 用SSRMethod（http：//www.agron.missouri.edu）提供的方法，95℃預(yù)變性10min，1 個(gè)循環(huán)；95℃變性1min，65℃退火1min（以后每個(gè)循環(huán)降低1℃），72℃ 1.5min，11 個(gè)降溫循環(huán)；95℃變性1min，55℃1min，72℃ 1.5min，共30 個(gè)循環(huán)；最后在72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，用4.5%的聚丙烯酰胺凝膠電泳在1×TAE 緩沖液中恒定85W 電泳45min，然后銀染和顯影照相。

表1 32 個(gè)自交系名稱及系譜來源

1.3 數(shù)據(jù)分析根據(jù)引物擴(kuò)增和電泳分離結(jié)果，建立SSR 的0-1 數(shù)據(jù)庫，每一個(gè)引物檢測一個(gè)染色體位點(diǎn)，每一個(gè)條帶視為一個(gè)等位基因，在相同遷移位置上（相同的分子量片段）有帶的記為1，無帶的記為0，缺失的記為9。采用Jaccard 系數(shù)的方法計(jì)算遺傳距離（GD，genetic distance），遺傳相似系數(shù)（GS，genetic similarity）GS=1-GD，采用類平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類作圖[6-7]，數(shù)據(jù)處理用DPS7.55 完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR 標(biāo)記檢測結(jié)果本研究應(yīng)用74 對SSR 引物對32 個(gè)玉米自交系進(jìn)行擴(kuò)增，其中63 對引物多態(tài)性好、帶型穩(wěn)定，其余11 對引物因?yàn)閿U(kuò)增效果較差，不能進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。統(tǒng)計(jì)的63 對SSR 引物分布于玉米10 條染色體上[6-8]，共檢測出298 個(gè)等位基因變異，每個(gè)引物檢測到2～10 個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)檢測到的等位基因數(shù)為4.73 個(gè)。在10 條染色體上分別檢測了7、5、9、5、6、6、5、6、5、9 個(gè)位點(diǎn)，分別檢測出36、20、37、25、32、35、21、28、17、47 個(gè)等位基因（表2）。圖1 為引物umc1506 對32 個(gè)自交系的擴(kuò)增圖譜。

2.2 遺傳距離利用Jaccard 法計(jì)算得到32 個(gè)玉米自交系的SSR 遺傳距離范圍是0.31～0.79，平均遺傳距離為0.55，表明供試的玉米自交系存在較大的遺傳差異。

2.3 聚類分析根據(jù)32 個(gè)自交系的SSR 遺傳差異系數(shù)矩陣，利用UPGMA 法進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖2 所示。在遺傳距離0.75 處，32 個(gè)自交系可以分為5 類，在遺傳距離0.73 處，第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ類又各分為2 個(gè)亞類，各類包含的自交系見表3。

從系譜親緣關(guān)系分析，SSR 聚類結(jié)果與系譜追蹤具有較好的一致性。其中，沃30 和沃抗L 都是來源于阿壩州純地方資源沃日抗旱玉米，92115、8111沃、97-81 都是沃30 的改良系，不同程度含有該地方血緣，試驗(yàn)結(jié)果也表明它們之間遺傳距離小，聚為一類；LBH-71、LMB-72 是涼山州兩個(gè)地方種質(zhì)的改良系，結(jié)果也和沃30 等自交系共同聚在第Ⅰ類，而第Ⅰ類中沒有其他外來自交系和標(biāo)準(zhǔn)測驗(yàn)自交系歸入，說明川西高海拔地區(qū)地方種質(zhì)資源遺傳類群相對獨(dú)立。丹340 和330 在聚類結(jié)果中歸為一類，與前人相關(guān)研究報(bào)道一致[9-10]，汶頂313 是汶川白玉米和330 的雜交后代，和330、丹340 一起聚在第Ⅱ類1 亞類；在第Ⅱ類2 亞類中，41、41330、9-432都含有Mo17 血緣，阿自50 是41 和1034 的雜交后代，聚在一起比較合理，4H43、4643 都是446 和oh43 的雜交后代，和Mo17 聚在一類的原因有待進(jìn)一步研究。JZ-223、MA17、D616 都是國外中早熟雜交種選育的自交系，試驗(yàn)結(jié)果同聚于第Ⅲ類1 亞類；P6113 和47813 同有太系113 血緣，47813 又有478 血緣，和478 一起歸在第Ⅲ類2 亞類。卡142、早28 都是加拿大早熟雜交種選育的自交系，歸在第Ⅳ類；WO98是丹598的后代，兩自交系聚在第Ⅴ類；9021、6131、8641、2417、216 為新引進(jìn)自交系，親緣關(guān)系不詳，分別被聚到不同的類群中。

表2 63 對SSR 引物在32 個(gè)玉米自交系中檢測到的基因數(shù)

3 討論

3.1 中緯度高海拔地方種質(zhì)資源研究與利用目前，我國玉米育種在資源利用上絕大部分還是以蘭卡斯特、瑞德、旅大紅骨、唐四平頭、PN 等為主[9-10]，遺傳基礎(chǔ)比較狹窄，眾多的地方資源沒有得到有效利用[11]。通過本研究的SSR 聚類結(jié)果可以看出，供試的中緯度高海拔地方種質(zhì)資源不能歸入國內(nèi)目前主要應(yīng)用的雜種優(yōu)勢群體，屬于一個(gè)相對獨(dú)立的遺傳群體，因此可以推測，高原中早熟地方種質(zhì)與我國主要的雜種優(yōu)勢群體都應(yīng)有較好的雜種優(yōu)勢。高海拔地區(qū)生態(tài)氣候復(fù)雜，土地干旱瘠薄，地方玉米種質(zhì)在當(dāng)?shù)鼐哂羞m應(yīng)性好、品質(zhì)優(yōu)等外來血緣不具備的優(yōu)點(diǎn)，但是在育種實(shí)踐中也發(fā)現(xiàn)，多數(shù)高原地方種質(zhì)資源抗病抗倒性較差，抗性、株型等缺陷難以保障在生產(chǎn)中直接利用[12-13]。因此可以根據(jù)本研究的聚類結(jié)果引入外來種質(zhì)資源對地方種質(zhì)進(jìn)行定向改良，同時(shí)還應(yīng)加強(qiáng)其他地方資源的收集和研究工作。

表3 32 個(gè)玉米自交系的SSR 聚類結(jié)果

3.2 SSR 聚類結(jié)果在雜種優(yōu)勢利用實(shí)踐中的體現(xiàn)供試的中早熟自交系中有6 個(gè)自交系已經(jīng)在中緯度高海拔地區(qū)組配出雜交組合并通過品種審定應(yīng)用于生產(chǎn)，其中地方資源沃30 組配出了阿單4 號（oh43×沃30）、阿單8 號（41×沃30）、金單四號（沃30×Mo17），92115 組配出了阿單9 號（446×92115）、阿單11 號（阿自50×92115），8111沃組配出了阿單12 號（Mo17×8111 沃）、阿單14號（41×8111 沃），這些組合多數(shù)都是高原地方種質(zhì)與蘭卡斯特種質(zhì)的優(yōu)勢體現(xiàn)，也與本研究中高原地方種質(zhì)獨(dú)立于蘭卡斯特群體的結(jié)果吻合。

3.3 本研究成果對今后高原玉米育種的指導(dǎo)和設(shè)想高原地方種質(zhì)相對獨(dú)立，因此在以后的育種實(shí)踐中，還應(yīng)加強(qiáng)該類群同瑞德等其他雜種優(yōu)勢群的利用研究。另一方面，新育成和新引進(jìn)的自交系在本研究中進(jìn)行了明確歸類，今后要利用這一研究成果并結(jié)合田間配合力測定等工作為中緯度高海拔地區(qū)玉米育種提供指導(dǎo)。