蛋白酶水解雞樅菌制備酶解液工藝優化及抗氧化活性

劉靜，李湘利，苗仙仙，魏海香，趙敏，薛麗萍

(濟寧學院 生命科學與工程系，濟寧市特色農產品高值化加工工程技術研究中心，山東 曲阜 273155)

自Harman提出自由基理論以來，機體氧化產生的自由基與衰老、疾病的關系備受關注[1]。自由基過剩可破壞機體功能和蛋白質、核酸、脂質等生物大分子結構，引發關節炎、動脈粥樣硬化、老年癡呆、糖尿病、癌癥等疾病[2]。自由基是導致油脂氧化的重要因素，食品的質地、風味、色澤等品質變化很可能是自由基導致的[3]。

雞樅菌(Termitomycesalbuminosus)營養豐富，味道鮮美，素有“山珍之最、苗中之冠”的美稱，有益胃、療痔止血、治痔等功效[4]。雞樅菌含有人體所需的氨基酸、蛋白質、維生素、鈣、磷、核黃酸等營養成分及多酚、纖維素酶、腦苷等成分，是補充人體所需物質的選擇之一[5]。雞樅菌中的生物活性成分多酚、多糖、黃酮等常被用在修復損傷器官、提高免疫力、消炎鎮痛及調節身體機能等方面[6]。

研究表明，雞樅菌酶解液及飲料制品具有較強的抗氧化活性[7]。為充分利用雞樅菌資源，應用蛋白酶進行高效提取加工，旨在制備具有抗氧化活性，集多糖、蛋白質及活性肽等功效成分于一體的營養液，為功能性食品的開發提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞樅菌：購于金鄉聯盛菌業有限公司，采后于55 ℃熱風干燥至恒重，粉粹過60目篩，得菌粉備用。

1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH·)、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS+·)、堿性蛋白酶(酶活100 U/mg)、中性蛋白酶(酶活100 U/mg)、木瓜蛋白酶(酶活800 U/mg)、菠蘿蛋白酶(酶活500 U/mg)：上海金穗生物有限公司；其他試劑：均為國產分析純。

TDL-60B低速臺式離心機 上海安亭儀器廠；PHS-3C pH計 上海儀電儀器有限公司；723PC分光光度計 上海菁華儀器有限公司；FCD2000電熱恒溫鼓風干燥箱 上海瑯玕設備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 雞樅菌酶解工藝

雞樅菌粉→加蒸餾水→pH調整→加蛋白酶→保溫酶解→100 ℃滅酶→離心(3000 r/min、30 min)→取上清液→雞樅菌酶解液。

1.2.2 蛋白酶的篩選

選取堿性蛋白酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶+菠蘿蛋白酶(1∶1)、木瓜蛋白酶+中性蛋白酶(1∶1)復合酶，在料液比1∶20、加酶量5000 U/g及推薦溫度和pH下酶解2.0 h，以水解度和DPPH·、ABTS+·、O2-·清除率為指標，確定最佳蛋白酶，條件見表1。

表1 4種蛋白酶的酶活力和作用條件Table 1 Enzyme activities and action conditions of four proteases

1.2.3 單因素試驗

選擇最佳蛋白酶，在加酶量5000 U/g、溫度50 ℃、pH 9、酶解2.0 h的條件下，研究料液比(1∶30、1∶25、1∶20、1∶17、1∶14)對水解度和DPPH·清除率的影響；在料液比1∶25、溫度50 ℃、pH 9、酶解2.0 h條件下，研究加酶量(2000，3000，4000，5000，6000 U/g)對水解度和DPPH·清除率的影響；在料液比1∶25、加酶量3000 U/g、pH 9、酶解2.0 h的條件下，研究溫度(40，45，50，55，60 ℃)對水解度和DPPH·清除率的影響；在料液比1∶25、加酶量3000 U/g、溫度45 ℃、酶解2.0 h的條件下，研究不同pH(7，8，9，10，11)對水解度和DPPH·清除率的影響；在料液比1∶25、加酶量3000 U/g、溫度45 ℃、pH 9的條件下，研究酶解時間(1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 h)對水解度和DPPH·清除率的影響。

1.2.4 正交試驗

在單因素試驗基礎上，以水解度和DPPH·清除率為指標，選取加酶量(A)、pH(B)、酶解溫度(C)和酶解時間(D)4個因素進行L9(34)正交試驗，制備酶解液，因素與水平見表2。

表2 正交試驗因素與水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments

1.2.5 水解度的測定

采用GB 5009.235-2016酸度計法測定氨基酸態氮含量(X)[8]，采用GB 5009.5-2016凱氏定氮法測定總氮含量(Y)[9]，計算水解度(DH)[10]。

1.2.6 自由基清除率的測定

于最佳條件制備酶解液，并稀釋(0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mg/mL)備用，以同濃度Vc為對照。

1.2.6.1 DPPH·清除率的測定

參照Floegel A等[11]的方法調整。酶解液2 mL，加入2 mL 0.01 mmol/L的DPPH·溶液，室溫避光反應30 min，以無水乙醇為參比，在517 nm測定吸光值(A1)；測定同體積無水乙醇和DPPH·溶液混勻后的吸光值(A2)及2 mL樣品溶液和2 mL無水乙醇混勻后的吸光值(A3)，計算DPPH·清除率。

1.2.6.2 ABTS+·清除率的測定

參考李湘利等[12]的方法調整。用2.45 mmol/L的過硫酸鉀配制7 mmol/L的ABTS+·儲備液，避光靜置12 h后用95%乙醇稀釋得ABTS+·測試液，使其在734 nm的吸光值為0.7±0.02。吸取1 mL酶解液，加入4 mL ABTS+·測試液，混勻靜置5 min后測吸光值(A)，并測定95%乙醇加4 mL ABTS+·測試液的吸光值(A0)，計算ABTS+·清除率。

1.2.6.3 O2-·清除率的測定

參考楊志剛等[13]的方法調整。吸取3 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3 mL，加入2 mL酶解液，用pH 8.2的Tris-HCl緩沖液定容至9 mL，以蒸餾水為參比，在325 nm下每30 s測一次吸光值，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標進行線性回歸，直線斜率為反應速率ΔA0、ΔA，計算O2-·清除率。

式中：ΔA0為鄰苯三酚的自氧化法速率；ΔA為加酶解液后鄰苯三酚自氧化法速率(單位均為每分鐘吸光值增加值)。

1.2.7 數據統計方法

采用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進行結果分析，用Microsoft Excel 2003的FORECAST函數計算自由基清除50%所需酶解液濃度(IC50)。

2 結果與分析

2.1 水解用酶的確定

圖1 不同酶的酶解效果Fig.1 The enzymatic hydrolysis effect of different enzymes

注：1為堿性蛋白酶；2為中性蛋白酶；3為菠蘿蛋白酶；4為木瓜蛋白酶；5為堿性蛋白酶+菠蘿蛋白酶；6為木瓜蛋白酶+中性蛋白酶。

由圖1可知，堿性蛋白酶和堿性蛋白酶+菠蘿蛋白酶的水解度最高，堿性蛋白酶水解的酶解液對DPPH·和O2-·的清除率較高，分別達到86.67%和54.55%，各酶解液對ABTS+·的清除率差異不大。這與各蛋白酶的酶切位點不同，與所得活性多肽、水解度及抗氧化產物提取率不同有關[14]。方差分析表明，堿性蛋白酶酶解液對DPPH·和O2-·的清除率顯著高于其他處理(P<0.05)。因此，選擇堿性蛋白酶制備酶解液。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 料液比對酶解效果的影響

圖2 料液比對水解度和DPPH·清除率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on hydrolysis degree and DPPH· clearance rate

由圖2可知，隨著料液比增大，水解度不斷升高，在料液比1∶17時達最大值66.04%。這是因為隨著料液比增大，酶和底物的接觸幾率增大，酶解更充分，但產物濃度增大也會抑制酶解反應[15]。DPPH·清除率隨著料液比增大呈現先增大后減小的趨勢，在料液比1∶25時清除率最高，可達48.81%(P>0.05)。為突出酶解液的抗氧化作用，選擇料液比1∶25為最佳料液比。

2.2.2 加酶量對酶解效果的影響

圖3 加酶量對水解度和DPPH·清除率的影響Fig.3 Effect of the additive amount of enzyme on hydrolysis degree and DPPH· clearance rate

由圖3可知，隨著加酶量增加，水解度升高，這與蛋白質被水解為低分子肽、氨基酸等產物有關[16]。隨著加酶量增加，DPPH·清除率呈先上升后下降的趨勢，在加酶量3000 U/g時清除率最高，達45.18%(P<0.05)，加酶量高于3000 U/g，酶解液的抗氧化能力減小，這可能是加酶量增大，酶和底物接觸更充分，部分抗氧化物質被酶解為無抗氧化活性產物所致[17]。綜合考慮，選擇加酶量2500，3000，3500 U/g進行正交試驗。

2.2.3 酶解溫度對酶解效果的影響

圖4 酶解溫度對水解度和DPPH·清除率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on hydrolysis degree and DPPH· clearance rate

由圖4可知，隨著溫度升高，水解度呈先升后降的趨勢，超過45 ℃水解度降低。因為酶在最適溫度范圍內，升高溫度可促進酶解反應，水解度增大；但溫度高于最適溫度時，酶穩定性降低，催化活性減弱，反應被抑制[18]。DPPH·清除率呈先升后降的趨勢，溫度50 ℃達到最高清除率58.56%(P<0.01)。這與溫度過高，酶活性減弱，多肽等抗氧化活性降低有關。水解度和DPPH·清除率在45～55 ℃相對較高，故選擇45，50，55 ℃進行正交試驗。

2.2.4 pH對酶解效果的影響

圖5 pH對水解度和DPPH·清除率的影響Fig.5 Effect of pH value on hydrolysis degree and DPPH· clearance rate

由圖5可知，隨著pH增大，水解度呈先增大后減小的變化趨勢，在pH 8時達到最大值41.74%，隨后逐漸減小，這是pH過高引起酶結構和活性改變所致[19]。pH 9時DPPH·清除率達到最大值64.59%(P<0.01)。pH 7～9時，水解度和DPPH·清除率相對較高，故選擇pH 7、pH 8、pH 9進行正交試驗。

2.2.5 酶解時間對酶解效果的影響

由圖6可知，隨著時間的延長，水解度增大。因為酶逐漸對底物進行酶解，所以水解度逐漸增加[20]。DPPH·清除率隨著時間延長呈先升后降的趨勢，酶解2.0 h時達最大值61.74%(P<0.01)。這可能是酶解時間過長，抗氧化多肽等活性物質被分解所致。故選擇酶解1.5，2.0，2.5 h進行正交試驗。

圖6 酶解時間對水解度和DPPH·清除率的影響Fig.6 Effect of enzymolysis time on hydrolysis degree and DPPH· clearance rate

2.3 正交試驗結果

固定料液比1∶25，選取加酶量(A)、pH(B)、酶解溫度(C)及酶解時間(D)為試驗因素，以DPPH·清除率和水解度為指標，設計L9(34)正交試驗，結果見表3。

表3 酶解工藝優化正交試驗設計和結果Table 3 Orthogonal experimental design and results of enzymatic hydrolysis technology optimization

由表3可知，對酶解液抗氧化活性影響的因素順序為B>D>A>C，即pH對抗氧化活性影響最大，酶解溫度的影響最小；最優條件為A3B1C1D3。影響水解度的因素順序為A>C>D>B，最優條件為A3B1C2D2。為深入探討酶解對抗氧化活性的影響，確定最優條件為加酶量3500 U/g，pH 7，45 ℃酶解2.5 h。

表4 DPPH·清除率方差分析Table 4 Analysis of variance on DPPH· clearance rate

注：P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。

由表4可知，在所選因素水平范圍內，pH(B)對抗氧化性的影響極顯著(P<0.01)，酶解時間(D)的影響顯著(P<0.05)，加酶量(A)與酶解溫度(C)的影響不顯著(P>0.05)。在正交優化條件下進行驗證試驗，所得雞樅菌酶解液對DPPH·的清除率可達73.23%，水解度達44.6%，均高于其他處理。

2.4 自由基清除試驗結果

2.4.1 對DPPH·的清除能力

圖7 酶解液對DPPH·的清除能力Fig.7 Scavenging ability of enzymatic hydrolysate to DPPH·

由圖7可知，隨著酶解液濃度增大，DPPH·清除率逐步升高，在0.4～1.2 mg/mL時趨于平緩，酶解液濃度為1.2 mg/mL時DPPH·清除率最高，達66.76%，其清除DPPH·的IC50為0.25 mg/mL，對DPPH·的清除能力低于同濃度Vc的清除能力(P<0.01)。

2.4.2 對ABTS+·的清除能力

由圖8可知，隨著酶解液濃度增加，ABTS+·清除能力增強，酶解液濃度為1.2 mg/mL時清除率達94.41%，清除ABTS+·的IC50為0.39 mg/mL，對ABTS+·的清除能力低于同濃度Vc的清除能力(P<0.01)。

2.4.3 對O2-·的清除能力

圖9 酶解液對O2-·的清除能力Fig.9 Scavenging capacity of enzymatic hydrolysate to O2-·

由圖9可知，隨著酶解液濃度增大，O2-· 清除能力逐漸升高，酶解液對O2-· 的清除率在1.2 mg/mL時達到最大值54.77%，對O2-· 的IC50為1.09 mg/mL，酶解液對O2-·的清除能力低于同濃度Vc的清除能力(P<0.01)。

3 結論

應用蛋白酶對雞樅菌進行酶解，在單因素試驗基礎上進行正交試驗，得出適宜雞樅菌水解的蛋白酶為堿性蛋白酶，最佳工藝條件為料液比1∶25，加酶量3500 U/g，pH 7，酶解溫度45 ℃，酶解時間2.5 h，此條件下所得雞樅菌蛋白水解度為44.6%，DPPH·清除率為73.23%。

雞樅菌酶解液濃度1.2 mg/mL時，對DPPH·、ABTS+·、O2-·的清除率分別達到最大值66.76%、94.41%、54.77%，其IC50分別為0.25，0.39，1.09 mg/mL。這說明雞樅菌酶解液具有較強的抗氧化能力，可用于功能性食品的開發。