石榴皮提取物的抑菌活性及其對冷卻雞肉保鮮效果

洪軍，李文玉，衛夏怡，吉冰潔，王少霞，毛銳

(河南城建學院 生命科學與工程學院 河南省水體污染防治與修復重點實驗室，河南 平頂山 467036)

隨著人們生活水平的不斷提高和安全營養食品的興起，人們越來越強調食品的純天然性和安全性。但肉類食品和調味品的防腐保鮮方面大多還是以添加化學防腐保鮮劑為主[1]，因此，尋求綠色、天然、安全的食品防腐保鮮劑以減少食源性致病菌的污染顯得尤為重要。作為生物源的食品防腐保鮮劑和調味品主要來源于微生物和動植物的天然產物，如Nisin、殼聚糖、迷迭香提取物、香辛料提取物等[2,3]。

迷迭香是一種重要的唇形科香草植物，主要含有鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酸、迷迭香酚等活性物質。因具有較強的抗氧化和抗菌特性，迷迭香及其提取物被廣泛地應用于肉制品、果蔬、水產品等食品防腐保鮮領域以及功能性食品和調味品中等[4]。石榴皮作為一種中藥材，其活性物質主要包括多酚、黃酮、生物堿等[5]，石榴皮提取物具有很好的抗氧化、清除自由基、抑制脂質過氧化和廣譜的抗菌功效，可用于水果、植物油、肉類和調味品醬油等中起到防腐保鮮作用[6-8]。Zhuang等研究表明，石榴皮提取物能延緩感官品質和肉色的惡化，抑制腐敗菌的生長，并能降低TVB-N的含量和ATP相關化合物的降解，使魚片的貨架期延長2 d左右，有望成為一種有前景的水產品防腐劑。賁浩使用石榴皮單寧、柚皮苷、大蒜素等復合保鮮劑作用于冷卻雞肉將其保鮮期延長至4 d[9]。覃宇悅等研究表明殼聚糖-石榴皮提取物復合膜是一種兼具抗菌和抗氧化效果的保鮮膜，能有效延長豬肉餅的保質期，較單一組合效果好，并能改善豬肉餅的品質[10]。

這些包含石榴皮的保鮮劑作用于冷卻肉中保質期較短，有些制備工藝較復雜，為了更好發揮其防腐保鮮作用，本研究擬通過石榴皮醇提物對5種食源性致病菌的抑菌作用進行分析，選擇適宜濃度進行單一或與其他生物源天然保鮮劑復合作用于冷卻雞肉，觀察其保鮮效果，為石榴皮復合保鮮劑的應用提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

供試藥物：石榴皮，購于平頂山市新城區國大藥房中藥材店；脂溶性迷迭香提取物、殼聚糖、Nisin，購于試劑公司。

供試菌種：腸炎沙門氏菌腸炎亞種ATCC14028、鼠傷寒沙門氏菌CMCC50115、李斯特氏菌、大腸桿菌ATCC25922、副溶血性弧菌ATCC17802，河南城建學院生科院課題組保存。

主要儀器：高速粉碎機、超聲波清洗儀、旋轉蒸發儀、生化培養箱、自動凱氏定氮儀、紫外分光光度計、pH計等。

1.2 石榴皮的提取及抑菌實驗

1.2.1 石榴皮提取物制備

超聲輔助醇提物制備：將石榴皮烘干，用高速粉碎機粉碎并過60目篩，稱取適量藥粉，按1∶25的料液比加入60%的食用乙醇，在200 W、50 ℃條件下超聲1 h，重復2～3次，然后真空抽濾，收集濾液[11,12]。

超聲輔助水提物制備：稱取適量藥粉，按1∶25的料液比加入蒸餾水，在200 W、70 ℃條件下超聲1 h, 然后將提取液用真空抽濾除去藥渣，并收集濾液。

在pH 2、溫度35 ℃條件下，用2%～3%活性炭脫色35 min，將過濾后的提取液減壓旋轉蒸發濃縮至1 g/mL。使用前在200 W、40 ℃條件下超聲除菌30 min，4 ℃冰箱保存備用。此濃度計算方法為石榴皮質量/濃縮液體積。

1.2.2 體外抑菌實驗

分別取100 μL活化好的食源性致病菌(腸炎沙門氏菌腸炎亞種ATCC14028、鼠傷寒沙門氏菌CMCC50115、李斯特氏菌、大腸桿菌ATCC25922以及副溶血性弧菌ATCC17802)稀釋至菌液濃度為107CFU/mL進行涂布。然后用打孔器在標記的位置進行打孔，在孔內加入制備好的80 μL藥液(石榴皮單一提取物或與其他食品添加劑復合物)，放入37 ℃培養箱中培養20～24 h，每組設3個平行，測定抑菌圈的直徑。抑菌圈直徑=測量所得直徑-打孔器直徑(8 mm)。

1.3 石榴皮提取物對冷卻雞肉保鮮測定

1.3.1 保鮮劑組成及制備方法

第一組：0.025 g/dL Nisin+1 g/dL殼聚糖(溶解于1%的醋酸溶液中)+0.03 g/dL迷迭香提取物+0.25 g/mL石榴皮粗提物；配制方法：取1 g/mL石榴皮提取物25 mL，依次加入0.03 g脂溶性迷迭香提取物干粉、0.025 g Nisin，攪拌均勻后，再加入用1%醋酸完全溶解的殼聚糖溶液，余量用無菌水補充即制備成復合保鮮劑。用前在200 W、40 ℃條件下超聲除菌30 min。

第二組：0.25 g/mL石榴皮粗提物；對照組：無菌水。

1.3.2 肉樣處理方法及指標測定

取新鮮雞胸脯肉在6～8 h內將雞肉中心溫度冷卻至4 ℃，將配制好的復合保鮮劑均勻涂抹于肉樣表面，超凈工作臺紫外照射30 min，用無菌紗布吸干多余的水分，然后用無菌真空包裝袋進行包裝，于4 ℃冰箱保存。每組設3個平行，分別在第0，2，4，6，8，10，12，14，16，18天取樣進行感官評定、TVB-N、TBARS、pH值、微生物總數測定。感官評定參照GB 2707-2016進行，評價表見表1；TVB-N的測定參照GB 5009.228-2016進行；TBARS的測定參考范碧琴[13]的方法進行；pH值的測定參考Wulf等[14]的方法進行，參考標準：新鮮肉pH 5.8～6.2，次鮮肉pH 6.3～6.6，變質肉pH>6.7；微生物指標的測定參照GB 4789.2-2016進行。

表1 感官評定表Table 1 Sensory evaluation

1.4 數據分析

所有數據均為3 次重復實驗計算得出，結果由平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 抑菌實驗結果與分析

表2 石榴皮水提物對5種食源性致病菌的抑菌圈大小Table 2 Inhibition zone size of water extracts from pomegranate peel on five food-borne pathogenic bacteria

表3 石榴皮醇提取物對5種食源性致病菌的抑菌圈大小Table 3 Inhibitory zone size of alcohol extracts from pomegranate peel against five food-borne pathogenic bacteria

由表2和表3可知，1 g/mL濃度的石榴皮水提物對5種食源性致病菌均有抑菌作用，但較同濃度的醇提物效果差，此結果表明不同提取方法對抑菌作用不同，可能是提取物中所含的主要成分有差別引起的。石榴皮醇提物除了對大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)為0.5 g/mL外，其余4種菌的MIC為0.25 g/mL。此結果與熊素英等通過不同方法獲得的石榴皮水、醇提取液對細菌、酵母、霉菌均有抑菌效果,對細菌的抑制效果最好，醇提物抑菌效果優于水提物，最低抑菌濃度為50%相一致[15]。為了達到更好的保鮮效果，將石榴皮醇提物分別與迷迭香、殼聚糖、Nisin進行復合，觀察其抑菌活性，結果表明石榴皮醇提物能與其他3種物質進行混合，無明顯拮抗作用，且有一定的疊加協同效果，見表4。

表4 石榴皮提取物與其他天然保鮮劑復合后對5種食源性致病菌的抑菌圈大小Table 4 Inhibition zone size of pomegranate peel extractscombined with other natural preservatives on fivefood-borne pathogenic bacteria

續 表

2.2 不同提取物對冷卻雞肉保鮮效果

2.2.1 不同處理組對雞肉冷藏期間TVB-N值的影響

TVB-N(揮發性鹽基氮)指動物性食品由于酶和細菌的作用，在肉類腐敗過程中，使蛋白質分解而產生氨以及胺類等堿性含氮物質，TVB-N含量是衡量肉類腐敗變質的重要指標之一，表明TVB-N含量越高，肉類新鮮度越低。

圖1 不同處理組對雞肉冷藏期間TVB-N值的影響Fig.1 Influence of different treatment groups on TVB-N values of chicken during refrigerated storage

由圖1可知，隨著冷藏時間的延長，各組數值也在逐漸增大，在第8天對照組的TVB-N值已經超過國家規定的鮮肉標準(15 mg/100 g)，第二組(單一石榴皮粗提物)則在第12天時已經超過鮮肉標準，第一組在第18天時仍小于15 mg/100 g，表明第一組對于TVB-N數值的增長有良好的抑制作用。此結果表明，含石榴皮粗提物復合組的保鮮效果較單一石榴皮粗提物好。

2.2.2 不同處理組對雞肉冷藏期間TBARS值的影響

圖2 不同處理組對雞肉冷藏期間TBARS值的影響Fig.2 Influence of different treatment groups on TBARS values of chicken during refrigerated storage

由圖2可知，隨著時間的延長，各組的肉樣均發生了不同程度的脂肪氧化，對照組的TBARS值增長最為明顯，第6天時對照組值為0.603 mg/100 g，超過了鮮肉標準0.5 mg/100 g，而第一組的TBARS值僅為0.3 mg/100 g，直至第16天超過鮮肉標準；第二組在第8天時為0.504 mg/100 g，超過鮮肉標準。此結果表明，0.25 g/mL石榴皮提取物具有一定的抗脂肪氧化能力，較對照組延長2 d以上，但是與其他添加劑配合效果更佳，可延長10 d左右。

2.2.3 不同處理組對雞肉冷藏期間pH值的影響

圖3 不同處理組對雞肉冷藏期間pH值的影響Fig.3 Influence of different treatment groups on pH values of chicken during refrigerated storage

由圖3可知，在雞肉冷藏初期，各組的pH值均有一定下降，對照組從第4天開始上升，各處理組均從第6天開始上升，對照組的數值明顯大于各處理組，在第8天時超出一級鮮肉標準(5.8～6.2)，由于存在殼聚糖溶解在1%醋酸的保鮮劑配方可能會對pH值產生一定的影響，第一組的pH值相對各組一直較低，在第12天時開始呈下降趨勢。這可能是因為雞肉在貯藏初期，大量的乳酸和磷酸的酸性物質的產生導致pH值下降。而隨著貯藏時間的増長，由蛋白質降解產生的多肽及氨基酸的增多導致pH值上升，上升程度代表著肉類的變質程度。此結果表明，實驗組均較對照組效果好，但石榴皮復合保鮮劑效果更佳。

2.2.4 不同處理組對雞肉冷藏期間菌落總數的影響

圖4 不同處理組對雞肉冷藏期間菌落總數的影響Fig.4 Influence of different treatment groups on total number of bacterial colony of chicken during refrigerated storage

由圖4可知，在雞肉冷藏期間，菌落總數一直呈持續增長狀態，對照組的數據增長趨勢明顯大于處理組，第8天對照組的菌落總數為1.9×106CFU/g，已超過鮮肉菌落總數的判定標準(106CFU/g)，第二組在第10天時超過了判定標準，而第一組的菌落總數相對較小，可知石榴皮復合保鮮劑相對單一石榴皮保鮮劑在肉樣上的抑菌效果更好。分析原因可能是石榴皮中的多酚類物質、黃酮類物質等抑制了部分細菌的生長，但是與Nisin、殼聚糖和迷迭香復合后，充分發揮了4種成分間協同增效的作用，更好抑制了微生物的生長，也抑制了蛋白質的分解速度，此結果也與TVB-N含量、感官評定的結果相吻合。

2.2.5 冷卻雞肉貯藏期間感官評定結果

隨著肉類放置時間的延長，肉類在腐敗變質時，因其組織成分的分解，使肉在色澤、氣味、彈性、粘度方面發生異常，感官質量明顯下降。因感官指標的變化要早于理化指標和微生物指標，因此感官指標的變化狀況可以作為肉質量標準的重要依據。

表5 冷卻雞肉貯藏期間感官評定結果Table 5 Sensory evaluation results of chicken during refrigerated storage

由表5可知，在各組的感官評定結果中，第一組綜合評定結果要優于其余各組，其次是單一石榴皮(第二組)。但因石榴皮提取物中含有一定的顏色，目前脫色效果不夠理想，對肉的色澤稍微有影響，但復合保鮮劑第一組在氣味、彈性方面明顯優于對照組。第8天時對照組已經出現明顯的腐敗臭味，肉色暗紅，表面粘手，肉色彈性很差；隨著保存時間的延長，第二組的各項感官評定結果也逐漸下降，由此可知在各處理組中第一組的保鮮效果較好。

3 結論

由體外抑菌實驗可知，石榴皮粗提物單一或復合物均對5種食源性致病菌的抑菌效果較好，且與其他生物源食品添加劑具有一定的協同作用。石榴皮復合物對冷卻雞肉的保鮮效果明顯優于對照組和單一石榴皮提取物，可將保鮮期延長10～12 d，0.25 g/mL石榴皮粗提物組將保鮮期延長4～5 d。此天然復合保鮮劑充分利用了各天然防腐保鮮劑的抑菌性、抗氧化性和成膜性，充分發揮了保鮮劑之間的協同增效作用，不僅可以增強其保鮮效果，而且具有調味增香、營養保健功能，延長了產品貨架期，從而減少其對冷卻肉品質的影響，提高其應用的安全性。根據此復合配方的功能，也可應用于調味品的防腐保鮮。