不同提取時間的艷山姜揮發(fā)油組分分析及其抑菌活性研究

鄒月，黃金鳳，魏琴，單謙，沈子豪，鄧超，王芹

(1.宜賓學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院 香料植物資源開發(fā)與利用四川省高校重點實驗室，四川 宜賓 644000；2.西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，成都 610039)

艷山姜(AlpiniazerumbetBurtt. et Smith)為姜科山姜屬植物，廣泛分布于中國東南部至西南部各省區(qū)。除作為觀賞植物外，其果實具有重要的藥用價值，如在2003版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中介紹其主治心腹冷痛、胸腹脹滿、消化不良、嘔吐腹瀉等癥狀[1]。艷山姜果實揮發(fā)油中α-蒎烯、莰烯、1,8-桉葉油醇及β-蒎烯等作為其主要活性物質(zhì)基礎(chǔ)[2]，具有一定的抗炎、鎮(zhèn)痛、防治心血管系統(tǒng)疾病和抑制因高糖誘導(dǎo)的疾病作用[3,4]。近年來，隨著種植面積擴(kuò)大[5]，產(chǎn)量逐年增加，國內(nèi)學(xué)者常使用GC-MS研究其化學(xué)成分，如張成川等通過分析艷山姜各部位化學(xué)成分發(fā)現(xiàn)其中含有許多熱不穩(wěn)定物質(zhì)[6,7]，故不同提取時間所得艷山姜揮發(fā)油化學(xué)成分有所差異，簡單地以提取率為目的的提取工藝無法合理地利用此資源。而使用GC-MS僅能檢測到樣品中化學(xué)成分的種類及其含量，不能像電子鼻一樣在較短的時間從整體上無損地對樣品風(fēng)味進(jìn)行分析，同時艷山姜果實揮發(fā)油的抗菌活性研究較少。

故本實驗結(jié)合GC-MS和電子鼻對不同提取時間的艷山姜揮發(fā)油的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行檢測，通過主成分分析(principal component analysis,PCA)對其成分進(jìn)行分析[8]，比較分析其抗菌活性，旨在揭示不同提取時間所得化合物變化情況及其抑菌效果的差異。為進(jìn)一步完善艷山姜果實揮發(fā)油提取工藝和提高其醫(yī)用等價值提供更加科學(xué)的依據(jù)，為艷山姜資源開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

艷山姜：干果，采自廣西省邕寧區(qū)，將艷山姜在干燥箱中40 ℃烘干，研磨成粉末過40目篩儲存。二氯甲烷：HPLC，成都科隆化學(xué)品有限公司；無水硫酸鈉：西隴科學(xué)股份有限公司；肉湯培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；LB培養(yǎng)基：杭州百思生物技術(shù)有限公司；其他化學(xué)試劑：均為分析純。

1.1.2 儀器

Agilent 7890A/5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS) 美國安捷倫公司；ME203電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Pen3型電子鼻 德國 Airsense 公司；LRH-250恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司。

1.1.3 菌種

供試病原菌菌株：金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusCICC 21600)；福氏志賀氏菌(ShigellaflexneriCICC 21534)；腸炎沙門氏菌(SalmonellaenteritidisCICC 21513)；出血性大腸埃希氏菌(EscherichiacoliEHEC CICC 21530)，由北京城市學(xué)院梁寒峭課題組和北京科技大學(xué)劉洋課題組提供。

1.2 供試品溶液的制備

取40 g艷山姜粉末置于1000 mL揮發(fā)油提取器中，加水混勻，浸泡1 h，使用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油[9]，選取揮發(fā)油得率為0.385～0.438 mL的時間(2，3，4，5，7，8 h)。停止加熱后，待提取器中油水自然分層時，取出上層油狀物質(zhì)，加入適量無水硫酸鈉，靜止過夜，干燥待用。

1.3 電子鼻分析

吸取精油0.1 mL加入25 mL 旋口頂空瓶中密封，在50 ℃恒溫30 min后上樣分析。樣品的檢測參數(shù)：進(jìn)樣量200 mL/min，進(jìn)樣時間60 s，延滯時間300 s。當(dāng)傳感器接觸到樣品揮發(fā)物后，電導(dǎo)率G會發(fā)生改變，且G與初始電導(dǎo)率G0的比值也隨之變化。響應(yīng)氣體濃度越大[10]，G/G0的值越偏離1(大于或小于1)。

1.4 GC-MS分析

1.4.1 樣品制備

將7個時間提取的揮發(fā)油經(jīng)無水硫酸鈉干燥后，加適量二氯甲烷稀釋樣品溶液，經(jīng) 0.22 μm 微孔濾膜過濾，進(jìn)行成分分析。

1.4.2 GC條件

HP-5MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；載氣(He)；流速1 mL/min，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度220 ℃；柱溫60 ℃用于0 min，然后以10 ℃/min 升溫到 190 ℃，保持 2 min；再以5 ℃/min升溫到 210 ℃。保持2 min；然后以10 ℃/min升溫到220 ℃，保持8 min，運行30 min。

1.4.3 MS條件

接口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；電子電離源；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍45～300 amu。

1.5 抑菌實驗

1.5.1 樣品制備1.5.1.1 菌液制備

將金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌于肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)2代后配制成1×108CFU/mL菌懸液，備用。

1.5.1.2 抗菌液制備

取提取時間為2，3，4，5，6，7，8 h的揮發(fā)油各0.1 mL用二甲基亞砜(DMSO)稀釋10倍，配制成100 μL/mL揮發(fā)油抗菌液。

1.5.2 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)[11]

將96 孔培養(yǎng)板用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液浸泡1 h后晾干，備用。配制1×103CFU/mL的4 種菌液，備用。在96孔培養(yǎng)板中用二倍稀釋法配制11個濃度梯度[12]。用移液槍往孔中分別注入11個濃度梯度抗菌液50 μL，肉湯培養(yǎng)基130 μL，4種菌液20 μL，得11個抗菌液濃度梯度25～0.024 μL/mL培養(yǎng)液，每個梯度重復(fù)3次，以空白培養(yǎng)基和DMSO作為對照。接種后，放于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h后取出觀察，將用肉眼看小孔內(nèi)澄清即在小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度記作MIC。從完全無菌生長的孔內(nèi)移取50 μL液體涂板，做3個重復(fù)，然后將培養(yǎng)皿放入37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，平板完全沒有菌生長出的最低濃度記作MBC。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子鼻實驗結(jié)果分析

若某個傳感器響應(yīng)值越遠(yuǎn)離1，它在樣品風(fēng)味形成中占據(jù)越重要的地位，反之，若越接近1則它在樣品風(fēng)味形成中占據(jù)的地位越低。檢測到的各個時間段揮發(fā)油氣味數(shù)據(jù)見圖1。

圖1 電子鼻艷山姜揮發(fā)油氣味響應(yīng)曲線(a為2 h，b為8 h)Fig.1 Response curves of flavor of volatile oils fromAlpinia zerumbet by e-nose

注：a為2 h，b為8 h。

在該電子鼻所有的10根金屬氧化物傳感器中[13]，艷山姜揮發(fā)油在W1S出現(xiàn)最高的響應(yīng)值，該傳感器對甲烷敏感，W2S、W5S上出現(xiàn)較高的響應(yīng)值，兩種傳感器分別對醇類和氮氧化合物靈敏，故推測甲基類、醇類、氮氧化合物等物質(zhì)為該揮發(fā)油的主要化合物。由該結(jié)果可知，揮發(fā)油中可能存在部分GC-MS未檢測出的氮氧化合物和硫化物，具體情況還需做進(jìn)一步研究。

圖2 艷山姜揮發(fā)油電子鼻PCA的得分圖(a)和載荷圖(b)Fig.2 Scoring plot (a) and loading plot (b) of volatile oils from Alpinia zerumbet byelectronic nose and PCA

選取平穩(wěn)時間段55～57 s的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14-1軟件中進(jìn)行PCA分析。由圖2可知，PCA將數(shù)據(jù)降維后第一主成分貢獻(xiàn)率為48.4%，第二主成分貢獻(xiàn)率為30.2%，第一主成分和第二主成分總貢獻(xiàn)率為78.6%，能代表大部分揮發(fā)油電子特征信息。在PCA分析中將7個樣品分為3類：第一類：2 h，第二類：3～7 h，第三類：8 h。Loading圖表示每個傳感器在區(qū)分樣品時的相對重要性。在第一主成分上，因W5S、W1S、W1W在載荷圖上貢獻(xiàn)值較大，即可知氮氧化合物、甲烷、硫化物可能為樣品區(qū)分為3類的主要差異物質(zhì)，在第二成分上5 h，6～8 h存在差異，主要是W2W、W2S、W6S貢獻(xiàn)值不同，即有機(jī)硫化物、乙醇、氫氣含量不同所致。

2.2 GC-MS實驗結(jié)果分析

GC-MS 共分離出38個化合物，通過 NIST 質(zhì)譜庫檢索結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[14,15]，確定化合物名稱，用色譜峰面積歸一化法計算揮發(fā)油成分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)，總共鑒定出36種化合物，均占揮發(fā)油總量的97.9%以上，結(jié)果見表1。

表1 不同提取時間艷山姜揮發(fā)油成分分析Table 1 Composition analysis of volatile oils from Alpinia zerumbet at different extraction time

續(xù) 表

艷山姜揮發(fā)油主要由單帖類(C10Hn)和倍半萜類(C15Hn)組成[16]，其中單帖類9種(18.44%～33.92%)，倍半萜24種(63.33%～78.63%)，其他物質(zhì)僅有3種(1.62%～2.25%)。其中(-)-β-杜松烯、α-畢橙茄醇、tau-Muurolol、1,8-桉葉油醇、β-蒎烯、石竹烯為艷山姜果實揮發(fā)油主要的化學(xué)成分。4 h前沸點的高低會對化合物提取造成影響，低沸點的單帖類在2 h和3 h時含量高于其他時間，高沸點的倍半萜類在2 h和3 h時含量低于其他時間，故可認(rèn)為不同時間提取的艷山姜果實揮發(fā)油的差異主要表現(xiàn)在單帖類和倍半萜的相對含量不同。

圖3 艷山姜揮發(fā)油化合物PCA得分圖Fig.3 PCA scoring plot of volatile oil compounds from Alpinia zerumbet

對7個時間提取揮發(fā)油的GC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，由圖3可知，第一主成分(PC-1)方差貢獻(xiàn)率為67.9%，第二主成分(PC-2)方差貢獻(xiàn)率為12.0%，累計貢獻(xiàn)率為79.9%，包含了樣品大部分信息。7個時間所提取的揮發(fā)油因化合物成分不同而區(qū)分開，可將此分為4類，分別為2 h，3 h，4～7 h，8 h。

表2 GC-MS 特征向量矩陣Table 2 GC-MS eigenvector matrix

續(xù) 表

由表2可知，4-萜烯醇(0.200)、1,8-桉葉油醇(0.200)、(-)-α-依蘭油烯(-0.199)，β-蒎烯(0.198)在第一主成分具有較大載荷，其中1,8-桉葉油醇含量在7.39%～14.9%之間，β-蒎烯含量在4.82%～11.65%之間，在區(qū)分2 h與其他時間氣味差異時起重要作用，2-異丙基-5-甲基-9-亞甲基雙環(huán)[4.4.0]DEC-1-烯(0.436)，α-依蘭油烯(-0.350)在第二主成分具有較大載荷，在區(qū)分8 h，3 h與4～7 h上起到重要作用。

2.3 揮發(fā)油抑菌結(jié)果分析

植物揮發(fā)油富含萜類化合物，可通過破壞其細(xì)胞膜對微生物產(chǎn)生抑制作用[17]。本研究中，艷山姜揮發(fā)油中含有的大量萜烯和萜醇[18]，如1,8-桉葉油醇、β-蒎烯、石竹烯、橙花叔醇等具有一定的抑菌活性。不同時間提取的艷山姜揮發(fā)油對各致病菌的MIC，MBC濃度見表3。

表3 艷山姜揮發(fā)油抑菌實驗結(jié)果Table 3 Bacteriostatic test results of volatile oils from Alpinia zerumbet μL/mL

兩個對照培養(yǎng)基中均有菌種生長，排除了DMSO的抑菌影響。由表3可知，艷山姜揮發(fā)油對所試3種陰性菌MIC的濃度(6.25～12.5 μL/mL)明顯高于金黃色葡萄球菌的MIC濃度(0.024～0.781 μL/mL)，說明艷山姜揮發(fā)油對4種供試菌均表現(xiàn)出抑菌活性，且對金黃色葡萄球菌的抑菌活性最佳。喬明鋒等[19]在研究花椒揮發(fā)油時發(fā)現(xiàn)其對陽性菌的抑制作用明顯，對陰性菌的抑菌活性較小，故可推測艷山姜果實揮發(fā)油對陽性菌的抑制效果優(yōu)于陰性菌。陳建煙在探究其葉片揮發(fā)油的抑菌活性時發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的抑菌活性與大腸桿菌相同，故可推測艷山姜果實與葉的抑菌效果可能不同，可對此做進(jìn)一步研究。

比較各時間所得揮發(fā)油的抑菌效果可得，2 h的揮發(fā)油對志賀氏菌的抑制效果最佳，MIC=6.25 μL/mL，MBC≤6.25 μL/mL，而此時1,8-桉葉油醇、β-蒎烯的濃度與其他提取時間相比最高，故1,8-桉葉油醇、β-蒎烯可能是艷山姜揮發(fā)油對志賀氏菌發(fā)生抑菌活性的主要化合物；6 h的揮發(fā)油對沙門氏菌的抑制效果最佳，MIC=12.5 μL/mL，MBC≤12.5 μL/mL；除2，7 h的揮發(fā)油抑菌效果較差外，其余時間所提取的揮發(fā)油對大腸桿菌的抑制效果均為MIC=12.5 μL/mL，MBC≤25 μL/mL；提取8 h的揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌的抑制效果最佳，MIC=0.024 μL/mL，MBC≤0.024 μL/mL，而此時1,8-桉葉油醇、β-蒎烯的濃度與其他提取時間相比最低，故1,8-桉葉油醇、β-蒎烯是艷山姜揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌發(fā)生抑菌作用的過程中不發(fā)揮主要作用的主要化合物。8 h的揮發(fā)油抑菌效果略優(yōu)于其他組，不同時間提取的揮發(fā)油抑菌效果存在差異，可能是其中化合物含量不同導(dǎo)致的。

3 結(jié)論

由本實驗電子鼻結(jié)果可知艷山姜揮發(fā)油在傳感器W1S、W2S、W5S出現(xiàn)較高的響應(yīng)值，說明甲基類、醇類、氮氧化合物等物質(zhì)是該揮發(fā)油的主要化合物。結(jié)合PCA可將7個樣品分為三類：第一類2 h，第二類3～7 h，第三類8 h。

利用GC-MS從艷山姜揮發(fā)油中共鑒定出36種揮發(fā)性物質(zhì)。在分析不同時間提取的艷山姜果實揮發(fā)油的差異時，主要表現(xiàn)在單帖類和倍半萜的相對含量不同。結(jié)合PCA對樣品做進(jìn)一步分析，可將樣品分為四類，分別為2 h，3 h，4～7 h，8 h，較電子鼻的分類更具體，可能是電子鼻對風(fēng)味較接近的樣品分類效果沒有GC-MS靈敏所致。

抗菌實驗表明艷山姜揮發(fā)油對4種供試菌均有抑菌活性。不同時間提取所得揮發(fā)油對不同細(xì)菌的抑制效果不同，提取8 h的揮發(fā)油抑菌效果略優(yōu)于其他組。

本研究通過結(jié)合電子鼻的無損檢測方法、GC-MS、抑菌實驗探索不同時間提取的艷山姜揮發(fā)油的差異，并進(jìn)行了定性定量的差異描述，發(fā)現(xiàn)電子鼻在區(qū)分差異較大的樣品時擁有無損、快速、簡單等優(yōu)勢，后續(xù)可通過結(jié)合GC-MS去改進(jìn)電子鼻檢測方法，以達(dá)到準(zhǔn)確、快速區(qū)分不同樣品的目的。