東北泡菜中抑菌微生物的分離篩選及鑒定

燕平梅，宋敏麗，趙文婧

(1.太原師范學院 生物系，太原 030619;2.土壤消毒活化綠色產業技術創新戰略聯盟，太原 030619)

泡菜是以白菜、蘿卜為主要原料，再配以辣椒、姜、大蒜等作為輔料，添加食鹽及其他調味品等，利用蔬菜自身的微生物或人工添加的微生物在厭氧條件下進行發酵產生的酸性食物。泡菜中含有豐富的營養,包含大量的各類維生素、胡蘿卜素、鈣、鐵、磷等元素，以及豐富的乳酸菌。蔬菜發酵初期，表面的雜菌數量大于乳酸菌。隨著發酵的進行，雜菌的種類和數量減少，乳酸菌數量迅速增加。發酵后期，泡菜中的微生物幾乎都是乳酸菌[1-3]。1930年，Pederson首次提出了蔬菜的乳酸發酵過程中明串珠菌起到了啟動的作用[4，5]。20世紀90年代后期研究較前期更深入，研究轉向泡菜中乳酸菌的演替規律。我國學者對泡菜發酵過程進行了研究[6-9]。主要致力于四川泡菜和韓國泡菜中微生物的研究，進行菌種分離、篩選、鑒定以及純化[10]，對于泡菜工業發展起到了舉足輕重的作用。

東北泡菜是東北地區的一種特色食物。常采用當地盛產的大白菜腌制而成，極具東北地方特色。但是東北泡菜與韓國泡菜和四川泡菜在輔料使用上不同，東北泡菜中使用的輔料除食鹽外，未添加其他輔料，這種泡菜也被稱為酸菜[11]。不斷有學者進行韓國泡菜和四川泡菜中微生物的研究，但對于東北泡菜中微生物的研究少之又少。因此，我們對東北泡菜中微生物進行分離、篩選和鑒定，分離有抑菌能力的微生物，對于進一步探究東北泡菜的發酵機理和營養價值具有重要意義。

抑菌微生物就是具有抑菌活性的一類微生物，也稱拮抗微生物[12]。泡菜作為一種食品，在腌制及發酵過程中難免會有各種微生物的存在。抑菌微生物的存在不僅要保證泡菜的食用安全，還要求不能改變泡菜原有的風味。因此，本研究以抑菌微生物的分離、篩選為出發點研究東北泡菜中的微生物及其抑菌功能，從而進一步了解東北泡菜的發酵本質和營養價值，促進東北泡菜工業的發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

于超市購買的袋裝延邊傳統泡菜，延吉市三勝食品泡菜廠生產。

1.1.2 菌株

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)；大腸桿菌(Escherichiacoli)。

1.1.3 試劑

細菌DNA提取試劑盒：生化試劑；Taq DNA 聚合酶：北京天根時代公司。

1.1.4 實驗儀器

Life Touch基因擴增儀 杭州博日科技有限公司；HYBAID LIMITED PCR儀、DcodeTM凝膠成像系統 Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 泡菜中乳酸菌的分離

采用BCG牛乳培養基分離泡菜中的乳酸菌，參照發酵工程實驗的方法[13]。

對東北泡菜進行不同濃度的稀釋，在BCG牛乳培養基平板上涂布，涂好的平板于30 ℃培養箱中倒置封口培養48 h，觀察菌落形態，篩選有變色圈的菌落。

1.2.2 抑菌能力的判斷

利用管碟法，在牛津杯中滴加乳酸菌發酵液離心后的上清液，以乳酸菌培養基MRS為對照試驗，判斷分離的乳酸菌抑菌能力的大小。

1.2.3 抑菌微生物的鑒定

1.2.3.1 革蘭氏染色鑒定

具體實驗操作方法參照《微生物學實驗》[14]。

1.2.3.2 過氧化氫酶實驗

用接種環取一小環菌涂抹于已滴有5%過氧化氫的玻片上，如有氣泡產生則為陽性，無氣泡則為陰性。

1.2.3.3 生理生化鑒定

應用API50CH試劑條和 API50CHL培養基按照廠商的指示說明，對分離菌株進行糖發酵反應，實驗結果由APILABPLUS(Version 3.3.3,Bio-Merieux,France)程序和標準分類法描述。

1.2.3.4 16S rRNA基因鑒定

基因組DNA提取：按照細菌基因組DNA提取試劑盒操作方法。

16S rRNA基因PCR擴增：以原核生物通用引物8F和1542R為上、下游引物擴增16S rRNA基因[15]。

fD1(5′-AGAGTTTGACCTCCTCCTGGCTCAG-3′)；

rD1(5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′)。

分別靶向大腸桿菌(Escherichiacoli)16S rRNA的8～27位和1525～1542位核苷酸。PCR產物為1.5 kb。

16S rRNA基因序列分析：測序及分析由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

2 結果與分析

2.1 分離微生物結果

圖1 分離的乳酸菌(48 h)Fig.1 Isolated Lactobacillus (48 h)

由圖1可知，在30 ℃下BCG培養基中培養48 h后，培養基表面有乳白色菌落，菌落較小，菌落呈圓形，中等大小，凸起，微白色，濕潤，邊緣整齊。菌落且周圍可看到明顯的變色圈，擬似為乳酸菌。分離出110株擬似乳酸菌，進行抑菌實驗。

2.2 抑菌實驗

a.抑制金黃色葡萄球菌

b.抑制大腸桿菌

注：圖中C為對照；A，B為乳酸菌發酵液抑菌實驗。

將分離乳酸菌的液體培養液加到牛津杯中培養48 h，可以看到牛津杯周圍有一個圓形區域沒有金黃色葡萄球菌菌落(見圖2中a)，其他地方有菌落生成，說明從泡菜中分離的乳酸菌可抑制金黃色葡萄球菌的生長。分離的110株擬似乳酸菌中有62株可抑制金黃色葡萄球菌的生長。由圖2中b可知，從泡菜中分離的乳酸菌可抑制大腸桿菌的生長。分離的110株擬似乳酸菌中有91株可抑制大腸桿菌的生長。

2.3 抑菌微生物的鑒定

2.3.1 革蘭氏染色及過氧化氫酶實驗結果

挑取邊緣光滑、圓形菌落的細菌進行革蘭氏染色，在油鏡下觀察，可看到為桿狀細菌，且菌體為紫色，說明細菌為革蘭氏陽性菌，由此判斷為擬似乳酸菌。

先在玻片上滴1滴5%過氧化氫，然后用接種針挑取1環菌涂抹于液體中，沒有氣泡產生，說明分離的菌過氧化氫反應為陰性，所以判斷分離的菌為擬似乳酸菌。

2.3.2 生理生化實驗

對分離有抑菌作用的153菌株進行糖發酵反應，應用API50CH試劑條和 API50CHL培養基鑒定，結果為62株抑制金黃色葡萄球菌的乳酸菌中11株為植物乳桿菌Lactobacillusplantarum；51株為Lactobacillusacidophilus。91株抑制大腸桿菌的乳酸菌中72株為植物乳桿菌Lactobacillusplantarum；19株為Lactobacillusbrevis。

表1 API50CH試劑條成分Table 1 Reagent components of API50CH

續 表

注：“+”表示陽性反應，“-”表示陰性反應。

2.3.3 16S rRNA基因鑒定

將具有抑菌作用的乳酸菌進行16S rRNA基因鑒定。 提取具有抑菌作用的乳酸菌的基因組DNA，以通用引物8F和1542R為上、下游引物擴增16S rRNA基因，結果見圖3 。將PCR擴增的具有抑菌作用的乳酸菌16S rRNA基因產物進行測序，結果為62株抑制金黃色葡萄球菌的乳酸菌中11株植物乳桿菌Lactobacillusplantarum；51株為Lactobacillusacidifarinae。91株抑制大腸桿菌的乳酸菌中72株為植物乳桿菌Lactobacillusplantarum；19株為Lactobacillusacidifarinae。

圖3 提取DNA模板的 PCR擴增反應圖譜Fig.3 PCR amplification response spectrum of DNA template

注：泳道M表示標樣；1，2表示乳酸菌PCR擴增反應圖譜。

3 討論

蔬菜收獲后表面所含的微生物種類多、數量大，如大白菜外葉含微生物約13×108個/g，但有益菌一般數量都較低。蔬菜發酵初期首先是附著在原料表面的雜菌不斷生長繁殖，主要有微球菌屬、單胞菌屬、酵母菌屬，也有腸道細菌屬、克雷伯氏菌屬、棒桿菌屬，同時乳酸菌也隨之增殖，乳酸菌主要為球狀乳桿菌、鏈球菌、明串珠菌、片球菌等[16，17]。隨著發酵的進行，雜菌的種類和數量減少，乳酸菌數量迅速增加，占細菌總數的比例不斷增加。發酵后期，泡菜中的微生物幾乎都是乳酸菌，乳酸菌大多為植物乳桿菌、短乳桿菌。前人研究發現乳酸菌不僅在泡菜風味方面起到關鍵的作用，還在泡菜發酵過程中起到抑制其他雜菌生長的作用[18，19]。本實驗結果得出東北泡菜的乳酸菌具有抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的作用，經生理生化(糖發酵反應)鑒定結果為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)，與前人的研究結果一致。

本實驗結果得出東北泡菜的乳酸菌具有抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的作用，經16S rRNA基因鑒定，結果為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、Lactobacillusacidifarinae，據資料報道[20]，Lactobacillusacidifarinae是在比利時的酸面團中發現的新菌種，此菌的16S rRNA基因序列和Lactobacillusbrevis的非常相近，可用糖發酵反應產物的不同來區別兩者。本實驗用生理生化(糖發酵反應)和基因鑒定泡菜中具有抑制作用的乳酸菌，由于Lactobacillusacidifarinae的16S rRNA基因序列和Lactobacillusbrevis的非常相近，難以區別，以糖發酵反應的結果作為鑒定的結果。