金絲小棗多酚的提取及抗氧化性和抑菌活性研究

張兆英，王君，宋立立，張亞楠，李欣

(滄州師范學院 生命科學學院，河北 滄州 061001)

植物多酚是一類廣泛存在于植物體內的具有多元酚結構的次生代謝物，主要存在于植物的皮、根、葉、果中[1]，具有較強的抗氧化、抗癌、抗菌、抗動脈硬化、降血糖等功效[2，3]。植物多酚的抑菌效果已成為研究熱點之一，植物多酚可作為天然的防腐劑添加到食品中，起到保鮮的效果。動物性食品中的蛋白質和脂肪可作為微生物的能量來源，動物性食品更易滋生有害致病菌。研究發現，將植物多酚作為天然防腐劑添加到魚肉、豬肉、牛肉羊肉及其制品中，能有效抑制細菌及真菌的生長，延緩食品品質下降的速度，同時能保持食品的原有風味[4，5]。植物多酚可作為純天然的調味品添加到醬鹵肉制品中，保持肉制品的色澤穩定、鮮亮[6]。植物多酚還能作為調味品應用于果汁、醬油、果醬等食品中，保持食品的顏色[7]。

棗(ZiziphusjujubaMill.)屬于鼠李科(Rhamnaceae)棗屬(Ziziphus)植物，與桃、李、栗、杏并稱為我國古代“五果”，是我國北方重要的果樹之一，其果實既可鮮食也可干食[8]。金絲小棗主要以干食為主，皮薄、肉厚、棗核小，是傳統的“藥食同源”食品。棗肉中營養豐富，含有大量糖類、蛋白質、氨基酸等營養成分，同時，還含有豐富的多糖、多酚、黃酮、皂苷等生物活性物質，具有抗氧化、抗炎、抗癌等功能，是理想的營養保健品[9]。

目前，針對葡萄多酚、芒果多酚、茶多酚等研究較多[10-12]，關于金絲小棗多酚抑菌性的研究未見有報道。植物多酚的提取方法較多，超聲波輔助提取法是經常被用到的方法之一，借助超聲波產生的“空化效應”，可以加速多酚的滲透速度[13]。本試驗采用超聲波輔助提取法提取金絲小棗中的多酚，并對其抗氧化性和抑菌活性進行分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣品

滄州金絲小棗。

1.1.2 試驗試劑

福林-酚試劑、沒食子酸：南京都萊試劑公司，分析純；Tris、鄰苯三酚、水楊酸、FeSO4：天津市光復精細化工研究所，分析純；H2O2、Na2HPO4、NaH2PO4：北京化工廠，分析純；對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺溶液、NaNO2、營養瓊脂培養基：天津市盛奧化學試劑有限公司，分析純；濃鹽酸、無水乙醇：天津市北辰方正試劑廠，分析純；枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、曲霉、根霉：滄州師范學院微生物實驗室提供。

1.1.3 試驗儀器

GZX-9070MBE數顯電熱鼓風干燥箱、DZKW-4電子恒溫水浴鍋、九陽料理機、AXTD4-低速離心機、723可見分光光度計、752紫外可見分光光度計、FS-250N超聲波清洗器、T-A1004N電子天平。

1.2 樣品預處理

將金絲小棗清洗干凈，烘干表面水分，切成棗片，于鼓風干燥箱中，在溫度60 ℃下，烘干3～4 d后，每隔0.5 h稱重，至恒重即可。將烘干的棗片用粉碎機進行粉碎，粉碎后過40目篩，獲得棗粉，密封干燥，保存備用。

1.3 試驗設計方案

1.3.1 單因素試驗

影響金絲小棗多酚提取的因素較多，針對超聲波輔助提取法，主要影響因素包括：提取劑濃度、超聲時間、料液比、超聲功率、超聲溫度，因此選擇這5個影響因素進行單因素試驗，每個影響因素設置6個水平，見表1。

表1 單因素試驗表Table 1 Single-factor experiment table

1.3.1.1 超聲時間

準確稱取0.5 g棗粉，加入60%的乙醇，料液比為1∶20，超聲功率為150 W，超聲溫度60 ℃下提取10，20，30，40，50，60 min，離心，獲得金絲小棗多酚提取液，重復3次，取平均值，分析超聲時間與多酚提取量的關系。

1.3.1.2 乙醇濃度

準確稱取0.5 g棗粉，加入40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，料液比為1∶20，超聲功率為150 W，超聲溫度60 ℃下提取40 min，離心，獲得金絲小棗多酚提取液，重復3次，取平均值，分析乙醇濃度與多酚提取量的關系。

1.3.1.3 料液比

準確稱取0.5 g棗粉，加入60%的乙醇，料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35，超聲功率為150 W，超聲溫度60 ℃下提取40 min，離心，獲得金絲小棗多酚提取液，重復3次，取平均值，分析料液比與多酚提取量的關系。

1.3.1.4 超聲功率

準確稱取0.5 g棗粉，加入60%的乙醇，料液比為1∶20，超聲功率為90，120，150，180，210，240 W，超聲溫度60 ℃下提取40 min，離心，獲得金絲小棗多酚提取液，重復3次，取平均值，分析超聲功率與多酚提取量的關系。

1.3.1.5 超聲溫度

準確稱取0.5 g棗粉，加入60%的乙醇，料液比為1∶20，溫度為50，55，60，65，70，75 ℃下提取40 min，離心，獲得金絲小棗多酚提取液，重復3次，取平均值，分析超聲溫度與多酚提取量的關系。

1.3.2 正交試驗

選取超聲時間、乙醇濃度、料液比、超聲功率和超聲溫度這5個因素，每個因素設定4個水平(見表2)進行L16(45)的正交試驗。按照L16(45)正交試驗表(見表3)進行編號。

表2 正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

表3 正交試驗設計表Table 3 The orthogonal experiment design

1.4 指標測定

1.4.1 標準曲線測定

以沒食子酸為對照品，采用福林-酚法測定多酚含量[14]，稍作修改。精密稱取25 mg沒食子酸，用蒸餾水定容至250 mL，即可得到0.1 mg/mL沒食子酸標準液。分別吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL于7支試管中，加入1.5 mL福林酚試劑，混勻，靜置5 min，加入3 mL 10% Na2CO3，搖勻后加蒸餾水定容至10 mL，40 ℃避光反應1 h，在760 nm波長處測定吸光度值。

1.4.2 金絲小棗多酚提取量測定

取4 mL的提取液，放置于25 mL容量瓶中，加入12 mL蒸餾水、1 mL福林-酚試劑，混勻，靜置5 min，加入5 mL 10%Na2CO3溶液，混勻后，用蒸餾水定容。40 ℃避光反應1 h，在760 nm波長處測定吸光度值。

W=(C×V)/m。

式中：W為多酚提取量(mg/g)；C為提取液多酚濃度(mg/mL)；V為提取液體積(mL)；m為棗的質量(g)。

1.4.3 清除亞硝酸根

取6支試管分別加入濃度為0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mg/mL的多酚溶液2 mL，5 μg/mL的NaNO2標準溶液1 mL，然后放到37 ℃恒溫水浴鍋中。30 min后取出，加入0.4%的對氨基苯磺酸2 mL，混勻，放置5 min，再加入0.2%的鹽酸萘乙二胺1 mL，加蒸餾水至20 mL，混勻，靜置15 min，于538 nm測其吸光度值，重復3次，取平均值。

清除率(%)=1-(A1-A2)。

式中：A1為加入提取液后的吸光度值，A2為金絲小棗多酚樣品的吸光度值。

1.4.4 清除羥自由基

采用水楊酸法。取5 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液2 mL、10 mmol/L的FeSO4溶液1 mL，混勻，分別加入濃度為0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mg/mL的金絲小棗多酚提取液2 mL，最后加入2 mL的H2O2，37 ℃下水浴反應30 min，于510 nm處測其吸光度值，重復3次，取平均值。

清除率(%)=1-(A1-A2)。

式中：A1為加入提取液后的吸光度值，A2為金絲小棗多酚樣品的吸光度值。

1.4.5 清除超氧自由基

采用鄰苯三酚法。取5支試管，分別量取10 mL的Tris-HCl(50 mmol/L，pH 8.2)緩沖溶液，在37 ℃恒溫下水浴反應20 min；之后加入3 mL蒸餾水和4 mL濃度分別為0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mg/mL的多酚提取液，搖勻，立即加入已預熱的鄰苯三酚1 mL，用0.01 mol/L HCl為參比，于325 nm測吸光度值，重復3次，取平均值。

清除率(%)=(A0-A1)/A0。

式中：A0為空白對照(不加提取液)的吸光度值，A1為加入提取液后的吸光度值。

1.5 抑菌試驗

1.5.1 菌種的活化

將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌分別接種到牛肉膏蛋白胨培養基中于37 ℃培養12 h；將曲霉、根霉分別接種到土豆蔗糖培養基中于28 ℃培養2～3 d[15]。

1.5.2 抑菌效果測定

用打孔器將濾紙打成直徑為10 mm 的圓片，將其滅菌，備用。將活化后的不同菌種分別接種到培養基中，設3次重復。將金絲小棗多酚原液用無菌水稀釋為0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35，0.40 mg/mL不同濃度的稀釋樣品，將滅菌的濾紙片浸入金絲小棗多酚稀釋液中30 min，然后用無菌鑷子取出，平鋪于已接種的培養基中，每個培養皿放置3個濾紙片，以無菌水作空白對照。枯草芽孢桿菌和大腸桿菌在37 ℃恒溫培養箱內培養 24 h，曲霉和根霉在28 ℃培養箱內培養48 h，觀察抑菌效果[16，17]。

2 結果與分析

2.1 多酚的標準曲線及回歸方程

以沒食子酸溶液濃度為橫坐標(X)，吸光度為縱坐標(Y)，繪制標準曲線(見圖1)，得到線性回歸方程為：Y=5.42X+0.0186，R2=0.9992。

圖1 多酚標準曲線Fig.1 The standard curve of polyphenols

2.2 金絲小棗多酚的提取

2.2.1 單因素試驗

2.2.1.1 超聲時間對金絲小棗多酚提取的影響

圖2 超聲時間對金絲小棗中多酚提取的影響Fig.2 The effect of ultrasonic time on polyphenols extraction from Ziziphus jujuba

由圖2可知，在超聲時間為10～40 min時，隨著時間的延長，金絲小棗多酚提取量呈現上升的趨勢；在超聲時間為40～60 min時，多酚提取量下降。超聲時間為40 min時，多酚提取量最高，為10.95 mg/g。因而，選取40 min作為金絲小棗多酚提取的最佳超聲時間。

2.2.1.2 乙醇濃度對金絲小棗多酚提取的影響

圖3 乙醇濃度對金絲小棗中多酚提取的影響Fig.3 The effect of ethanol concentration on polyphenols extraction from Ziziphus jujuba

由圖3可知，在乙醇濃度為40%～50%時，金絲小棗多酚提取量緩緩上升；當濃度為50%～90%時，多酚提取量急劇下降；乙醇濃度為50%時，多酚提取量達到最高，為11.15 mg/g。因此，選取50%作為金絲小棗多酚提取的最佳乙醇濃度。

2.2.1.3 料液比對金絲小棗多酚提取的影響

圖4 料液比對金絲小棗中多酚提取的影響Fig.4 The effect form solid-liquid ratio on polyphenols extraction from Ziziphus jujuba

由圖4可知，當料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35時，金絲小棗多酚提取量分別為10.35，11.80，9.75，7.75，7.10，5.70 mg/g。即在料液比為1∶15時，金絲小棗多酚提取量最高。因此，選取1∶15作為金絲小棗多酚提取的最佳料液比。

2.2.1.4 超聲功率對金絲小棗多酚提取的影響

圖5 超聲功率對金絲小棗中多酚提取的影響Fig.5 The effect of ultrasonic power on polyphenols extraction from Ziziphus jujuba

由圖5可知，當超聲功率為90～150 W時，金絲小棗多酚提取量逐漸上升；當超聲功率為150～240 W時，金絲小棗多酚提取量呈現平緩的下降。在超聲功率為150 W時，金絲小棗多酚提取量最高，為11.85 mg/g。因而，選取150 W作為金絲小棗多酚提取的最佳超聲功率。

2.2.1.5 超聲溫度對金絲小棗多酚提取的影響

圖6 超聲溫度對金絲小棗中多酚提取的影響Fig.6 The effect of ultrasonic temperature on polyphenolsextraction from Ziziphus jujuba

由圖6可知，當超聲溫度為50～55 ℃時，金絲小棗多酚提取量逐漸增加；在超聲溫度為55～75 ℃時，多酚提取量下降。在超聲溫度為55 ℃時，金絲小棗多酚提取量達到12.05 mg/g。所以，選取55 ℃作為金絲小棗多酚提取的最佳超聲溫度。

2.2.2 正交試驗

表4 正交試驗結果Table 4 The results of orthogonal experiment

由表4正交試驗結果可知，超聲波輔助法提取金絲小棗多酚的最佳提取工藝為：超聲時間30 min、乙醇濃度50%、料液比1∶15、超聲功率210 W、超聲溫度50 ℃，此條件下，金絲小棗多酚提取量為12.45 mg/g。5個因素對多酚提取量的影響程度不同，因素主次順序為：料液比>乙醇濃度>超聲功率>超聲溫度>超聲時間。

2.3 金絲小棗多酚的抗氧化性試驗

2.3.1 清除亞硝酸根

由圖7可知，隨著金絲小棗多酚濃度的增加，其清除亞硝酸根的能力增強；當多酚濃度為0.20 mg/mL時，清除能力最強，對亞硝酸根的清除率最高，為99.8%；當多酚濃度為0.25 mg/mL時，其清除率略有下降。

圖7 多酚濃度對清除亞硝酸根的影響Fig.7 The effect of polyphenols concentration on scavenging of nitrite

2.3.2 清除羥自由基

圖8 多酚濃度對清除羥自由基的影響Fig.8 The effect of polyphenols concentration on scavenging of hydroxyl radicals

由圖8可知，隨著金絲小棗多酚濃度的增加，其清除能力逐漸增強；在多酚濃度為0.15 mg/mL時，其對羥自由基的清除率達到99.3%。當金絲小棗多酚濃度大于0.15 mg/mL時，其清除能力隨多酚濃度的增加變化平緩。

2.3.3 清除超氧自由基

圖9 多酚濃度對清除超氧自由基的影響Fig.9 The effect of polyphenols concentration on scavenging of superoxide free radicals

由圖9可知，隨著金絲小棗多酚濃度的增加，其對超氧自由基的清除能力逐漸增強。當金絲小棗多酚濃度為0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mg/mL時，其清除率分別為44.30%、49.70%、53.90%、53.50%、54.10%。

2.4 金絲小棗多酚抑菌活性試驗

植物多酚能夠破壞微生物的細胞壁和細胞膜，使膜的流動性降低，通透性增加，對微生物的細胞形態造成不可逆的改變，從而起到殺菌的作用[18-20]。

表5 不同濃度金絲小棗多酚提取液抑菌效果Table 5 Antibacterial effect of polyphenol extract with different concentration from Ziziphus jujuba

注: “-”表示無抑菌效果，菌落正常生長。

由表5可知，隨著金絲小棗多酚濃度的增加，抑菌圈逐漸加大，表明金絲小棗多酚的抑菌能力與其濃度相關。金絲小棗多酚對4種菌均有抑制效果，抑制作用大小順序為：曲霉>枯草芽孢桿菌>大腸桿菌>根霉。金絲小棗多酚對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、曲霉3種菌的最小抑菌濃度為0.15 mg/mL；對根霉的最小抑菌濃度為0.20 mg/mL。金絲小棗多酚對細菌和真菌都有不同程度的抑制作用。

3 結論

采用超聲波輔助法提取金絲小棗多酚，通過單因素試驗和正交試驗，得到金絲小棗多酚的最佳提取工藝：超聲時間30 min、乙醇濃度50%、料液比1∶15、超聲功率210 W、超聲溫度50 ℃，此條件下多酚提取量為12.45 mg/g。影響金絲小棗多酚提取的因素主次順序為：料液比>乙醇濃度>超聲功率>超聲溫度>超聲時間。抗氧化性試驗顯示，金絲小棗多酚對亞硝酸根、羥自由基和超氧自由基具有清除作用，并且，隨著金絲小棗多酚濃度的增加，其清除能力增強。通過抑菌試驗可以看出，金絲小棗多酚對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、曲霉、根霉4種菌都有不同程度的抑制作用，且抑制效果隨金絲小棗多酚濃度的增加而更加明顯。說明金絲小棗多酚對真菌和細菌都能起到抑制作用。金絲小棗多酚可作為天然的防腐劑添加到動物性食品中，延長食品的保鮮期，亦可作為調味品添加到果汁、糕點等食品中，保持食品的色澤穩定。