可降解亞硝酸鹽植物乳桿菌在廣式臘腸發酵中的應用

陳桂柳，盧超銳，劉雪萍，吳長力，林夢哲，陳穎琪，張宏梅

(廣東工業大學 生物工程系，廣州 510006)

廣式臘腸具有非常悠久的歷史，深受廣大消費者的喜愛。但傳統臘腸的制作以作坊形式為主，具有規模小、產品性質不穩定的特征，同時也存在產品的安全性問題。發酵肉制品中的亞硝酸鹽殘留問題是食品安全領域中非常重要的內容[1,2]。因為亞硝酸鹽具有優異的發色和抑菌能力，所以它是一種在食品生產中特別是在肉制品制造業中常用的食品添加劑，但它卻有致畸、致癌、致甲狀腺腫大等危害[3,4]。因此，急需找到一種能夠降解發酵肉制品中亞硝酸鹽的辦法。

目前亞硝酸鹽的降解辦法主要有物理法、化學法和微生物法3種，微生物法基于其經濟、高效等特點得到廣泛的重視，其主要是通過菌株如硝化細菌中的假單胞菌(Pseudomonassp.)、芽孢桿菌(Bacillussp.)或發酵中用到的乳酸菌(Lactobacillussp.)等對亞硝酸鹽進行降解。解決發酵食品中亞硝酸鹽安全問題的最為理想的途徑之一，就是從具有代表性的發酵食品中篩選出高效降解亞硝酸鹽的乳酸菌菌株作為發酵劑，添加到發酵肉制品中，在改善產品性能的同時提高產品的安全性[5-9]。

本研究以前期在泡菜中分離的兩株植物乳桿菌為研究對象，分析其耐氯化鈉和耐亞硝酸鈉的特征以及降解亞硝酸鹽的能力，并將其中一株植物乳桿菌應用到廣式臘腸發酵中，通過檢測其理化性質和微生物學特征，以探討其作為廣式臘腸發酵劑的可行性。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養基

實驗菌株：實驗所用的菌株分別是LactobacillusplantarumH1和LactobacillusplantarumL1。由本實驗室前期從潮汕泡菜中分離得到，并經過革蘭氏染色、產乳酸分析、過氧化氫酶分析等生化實驗和16S rDNA序列分析鑒定為植物乳桿菌，并于-20 ℃添加20%甘油保護劑低溫保存。

培養基：MRS肉湯、PALCAM瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂、GYP培養基、孟加拉紅培養基等，均購自青島海博生物技術有限公司。

1.2 植物乳桿菌對氯化鈉和亞硝酸鈉耐受性的研究

配制50 mL的MRS培養基，經118 ℃高壓滅菌15 min，備用。從-20 ℃冰箱中取出菌株，待培養基冷卻至室溫時，分別吸取50 μL菌液于培養基中，并將培養基移至恒溫搖床中，30 ℃培養48 h。

在GYP培養基中，加入2.0%的氯化鈉或 300 mg/kg的亞硝酸鈉，以不加任何其他物質作為空白對照，平行3個樣本。移取乳酸菌液于離心管中，5000 r/min ，4 ℃下離心5 min后舍棄上清液，用10 mL的無菌PBS緩沖液清洗乳酸菌，并用50 mL PBS緩沖液懸浮乳酸菌。以1%的接種量(大約為7.0 log CFU/mL)接種于GYP培養基中(含有氯化鈉或亞硝酸鈉)以及空白對照培養基中。置于恒溫搖床30 ℃培養72 h后，使用分光光度計法，在波長660 nm處測量培養基的光密度值[10]。

乳酸菌存活率=(含氯化鈉或亞硝酸鈉GYP培養基的OD值)/(不含鹽GYP培養基的OD值)×100%。

1.3 植物乳桿菌對亞硝酸鹽降解能力的研究

亞硝酸鹽的檢測參照GB 5009.33-2016中的分光光度法進行。將待測液2 mL置于50 mL帶塞比色管中，先加入2 mL對氨基苯磺酸溶液混勻，然后避光靜置5 min，再加入1 mL鹽酸萘乙二胺溶液，用去離子水定容至刻度，搖勻后避光靜置15 min，于538 nm處測量其吸光度。

標準曲線的繪制：分別準確吸取0.00，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.50，2.00，2.50 mL的亞硝酸鈉標準使用液(相當于 0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，7.5，10.0，12.5 μg 亞硝酸鈉)置于50 mL帶塞比色管中，經紫外分光光度法測定后，繪制成標準曲線。

按1∶1000的接種量將濃度為108CFU/mL的乳酸菌分別接種到含適量NaNO2(160 μg/mL)的MRS培養基后，將pH值調為6.5，30 ℃培養，每隔12 h吸取菌液測量其亞硝酸鹽含量。菌液均需經過前處理才可對其進行測量，前處理步驟如下：吸取菌液5 mL于250 mL的帶塞錐形瓶中，加入12.5 mL硼砂溶液后沸水浴15 min后將提取液轉移到200 mL容量瓶中，先后加入5 mL亞鐵氰化鉀溶液和5 mL乙酸鋅溶液，搖勻，沉淀蛋白質，加入去離子水至刻度，搖勻后室溫靜置30 min以去除上層脂肪，用濾紙過濾上清液，棄去30 mL初濾液，吸取2 mL剩下的濾液采用分光光度法測定亞硝酸鹽含量。

1.4 廣式臘腸的制備

將接種了植物乳桿菌H1的100 mL MRS培養基過夜培養，離心分離獲得菌體后，用無菌PBS洗滌并用10 mL PBS懸浮菌體，使菌體濃度達到105CFU/mL。

將新鮮豬肉中的肥瘦分開，攪碎后按比例混合，肥瘦比例為2∶8，按肉重加入300 mg/kg亞硝酸鈉、2%氯化鈉、0.1%抗壞血酸鈉、1%葡萄糖、0.6%蔗糖和0.88%香料混合物，充分攪拌5 min混合均勻。腌制1 h，紫外滅菌20 min。將腌制好的豬肉分成每份100 g，共6份。其中3份以1%的接種量(約為8.0 log CFU/g)的發酵劑接種在肉料中，另外3份則加入等量的生理鹽水。將接種后的肉料填充到豬腸衣中。制成的臘腸先存放在超凈工作臺中，以除去腸衣表面的水分。臘腸表面無明顯潤濕感時，將臘腸懸掛在室內陰涼通風處自然風干，室內溫度保持在20 ℃。

1.5 發酵的臘腸在發酵和干燥過程中微生物的檢測

將發酵的臘腸在不同時間(0，1，2，5，8，14，21 d)進行取樣檢測其乳酸菌、霉菌和大腸菌群的數量。其中，乳酸菌采用溴甲酚紫固體培養基，霉菌采用孟加拉紅培養基，大腸菌群采用XLD瓊脂。計數方法參照國家標準[11-13]。

1.6 臘腸在發酵和干燥過程中pH值與水活度的測定

將發酵的臘腸在不同時間(0，1，2，5，8，14，21 d)進行取樣，分別采用pH計(上海精密科學儀器有限公司)和水活度測定儀(無錫市華科儀器儀表有限公司)測定其pH值和水活度的大小。

1.7 數據統計與分析

實驗均重復3次，采用Origin 8.0進行數據的分析和統計。

2 結果與討論

2.1 植物乳桿菌對氯化鈉和亞硝酸鈉耐受性的研究

由表1可知，H1和L1兩株菌在2.0%氯化鈉的培養基中生長不受抑制。300 mg/kg亞硝酸鈉不能對L1菌的生長產生抑制，而對H1菌有較小的抑制。已有研究表明起始濃度為6.0 log CFU/mL的植物乳桿菌可在濃度為100 mg/L(100 mg/kg)Na2NO2的條件下生長，表明該乳酸菌對亞硝酸鈉的耐受能力高[14]。因此，本研究結果表明H1菌和L1菌有更強的耐亞硝酸鹽能力。

表1 乳酸菌在含氯化鈉或亞硝酸鈉培養基中的活性Table 1 Activity of Lactobacillus in culture medium containing sodium chloride or sodium nitrite

注：數據中的“±”表示標準差。當菌的活性在100%以下時，可視為該菌在對應培養基中的生長受到抑制；當菌的活性約為100%時，可視為該菌在對應培養基中的生長不受影響；當菌的活性在100%以上時，可視為該菌對應的培養基中存在能促進該菌生長的因素。

2.2 植物乳桿菌對亞硝酸鹽降解能力的研究

圖1 兩株植物乳桿菌對亞硝酸鹽的降解能力Fig.1 Degradation capability of nitrite by twoLactobacillus plantarum strains

由圖1可知，兩株植物乳桿菌在MRS培養基中對亞硝酸鹽均具有較好的降解能力，在第12～24 h期間，降解速度最快，H1菌對亞硝酸鹽的降解率從11.8%增加到92.9%，L1菌對亞硝酸鹽的降解率從9.6%增加到77.0%，在第36 h時，兩株植物乳桿菌幾乎將亞硝酸鹽全部降解。有文獻表明，來自泡菜的植物乳桿菌5-7-3對亞硝酸鹽的降解率為89.94%[15]。因此，在本實驗中同樣來自泡菜的植物乳桿菌L1和H1也表現出了較好的亞硝酸鹽降解能力。

2.3 臘腸在發酵過程中乳酸菌活菌數、pH值和水活度的變化

在傳統的廣式臘腸中添加H1菌作為發酵劑，通過在不同時間下測定其乳酸菌活菌數、pH值以及水活度來探討該菌株作為發酵劑的可行性，結果見圖2。

圖2 發酵臘腸中乳酸菌活菌數、pH和水活度的變化Fig.2 Changes in the number of live bacteria, pH and wateractivity of Lactobacillus in fermented sausage

注：A表示臘腸在發酵過程中乳酸菌活菌數與發酵天數的關系；B表示臘腸在發酵過程中pH值與發酵天數的關系；C表示臘腸在發酵過程中水活度與發酵天數的關系。

由圖2中A可知，添加了H1菌的發酵臘腸的乳酸菌活菌數多于不添加H1菌的發酵臘腸的乳酸菌活菌數。在發酵的前2 d內，兩種發酵臘腸中的乳酸菌都快速生長，乳酸菌處在對數生長期。在發酵的第2～8 d之間，添加了H1菌的發酵臘腸的乳酸菌活菌數生長速率減小，但總活菌數還是有增長的趨勢，乳酸菌處于生長平穩期。而沒有添加H1菌的發酵臘腸的乳酸菌活菌數先增長后減少。到第8天后，兩種發酵臘腸的乳酸菌總數都呈現持續減少的趨勢，且隨著發酵天數的增加，減少的速率越快。

由圖2中B可知，在發酵的第0～5 d，兩種發酵臘腸的pH值持續快速降低，添加了H1菌的發酵臘腸的pH值比未添加H1菌的發酵臘腸的pH值低。在發酵的第5天后，兩者的pH值都持續緩慢下降，但添加H1菌的pH值始終比不添加H1菌的低，說明添加H1菌會降低臘腸的pH值。

由圖2中C可知，添加了植物乳桿菌H1的發酵臘腸的水活度與傳統發酵臘腸相比，在發酵的第0～5 d水分活度變化不大，但第5天后，添加植物乳桿菌H1會影響臘腸的水活度，相對傳統發酵，能使其水活度降低。

2.4 臘腸在發酵過程中有害菌的測定

表2 發酵臘腸中霉菌生長情況Table 2 Growth of mold in fermented sausage

注：涂布平板使用的樣液均稀釋至104倍；“+”表示培養基上霉菌菌落的數量為0～50個，“++”表示培養基上霉菌菌落的數量為50～100個，“+++”表示培養基上霉菌菌落的數量在100個以上，“-”表示培養基上無霉菌菌落。

由表2可知，兩種臘腸在發酵的第0天時，已經存在霉菌。不添加H1菌的發酵臘腸中的霉菌菌落數量隨著發酵天數的增加而增多，到發酵第14天才開始減少。添加了H1菌的臘腸中霉菌在發酵第0～5 d之間呈增長趨勢，而第5天時，霉菌的數量開始減少，到第14 天時，已經檢測不到霉菌。說明添加H1菌可以減少有害菌的數量。

2.5 發酵臘腸中大腸桿菌的測定

表3 發酵臘腸中大腸桿菌數量Table 3 Quantity of Escherichia coli in fermented sausage

注：國家衛生標準規定大腸桿菌在食品中含量不得超過30 CFU/100 g，如超過則判定為樣品不合格。

由表3可知，兩種臘腸在發酵第0天時，都未檢測到大腸桿菌。在發酵的第1～3 d，在不添加H1菌的發酵臘腸中檢測到大腸桿菌，而在同時期添加H1菌的發酵臘腸中未檢測到大腸桿菌，說明H1菌對大腸桿菌的生長繁殖有抑制效果。

3 結論

傳統廣式臘腸制作的過程中，參與發酵的微生物種類很多，乳酸菌是非常重要的一類。文中的兩株植物乳桿菌均具有良好的耐鹽和耐亞硝酸鈉能力，同時表現出對亞硝酸鈉有良好的降解能力。選擇H1菌作為臘腸進行發酵劑進行實驗，檢測了發酵臘腸的乳酸菌活菌數、霉菌數、大腸桿菌含量、pH值和水活度，對比空白對照的發酵臘腸，探討H1菌應用到發酵臘腸后對這些數值造成的影響。從實驗結果來看，H1菌對發酵臘腸的pH值影響較大，可以降低產品的水活度，同時有可能會對大腸桿菌和霉菌造成抑制效果。說明所選乳酸菌菌株具有較好的環境適應性，并顯示出很大的酸化潛力，可以通過抑制致病菌的生長來提高生物安全性。因此，H1菌有望成為一種具有生物安全性的本土發酵劑。另外，臘腸發酵中，菌株的種類多樣，植物乳桿菌與其他菌可能存在著營養的競爭關系，也可能是脅迫條件的協同生存。我們將深入研究臘腸中的菌群結構，以及發酵劑菌株與其他菌株之間的相互作用，使產品優良的性狀具有穩定性。為實現廣式臘腸生產的規模化、規范化以及保證產品的安全性研究奠定了科學基礎。