基于中效方程的黃芩苷與小檗堿抗炎協同作用研究

蔣 晴，羅 煜，朱正文，梁雨生，吳嘉思，蘇絲雨，曾 勇，孟憲麗，王 平

(成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611137)

黃芩苷和小檗堿分別是清熱解毒藥黃芩和黃連及其復方口服后主要的入血成分[1]，二者體內外實驗均表現出良好的抗炎活性[2,3]，但聯合應用的合理性研究還未見報道。本實驗研究黃芩苷和小檗堿聯合對經典炎癥通路關鍵節點的影響，評價二者合用相關機制。

1 材料

1.1 細胞小鼠腹腔巨噬細胞株(RAW 264.7)，購自中國科學院細胞庫。

1.2 藥物與試劑黃芩苷(批號AF7061702)、鹽酸小檗堿(批號AF8011015)、穿心蓮內酯(批號AF7072353)，購自成都埃法生物科技有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α) 檢測試劑盒(批號A28281022)、白介素-6(IL-6)檢測試劑盒(批號A20680724)，購自聯科生物技術有限公司；一氧化氮(NO)檢測試劑盒(批號S0021，碧云天生物研究所)；磷酸化蛋白核因子κB p65(phospho- nuclear factor kappa B p65，p-p65)、p65、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)抗體(美國Cell Signaling 公司)。

1.3 儀器AE2000雙目顯微鏡(Motic)；二氧化碳培養箱、酶標儀(Thermo Scientific)；蛋白垂直電泳儀(Bio-Rad)。

Tab 1 Drug concentration table

Bai: baicalin. Ber: berberine.

2 方法

2.1 細胞培養采用DMEM高糖培養基(含10%胎牛血清)培養RAW 264.7細胞。

2.2 細胞分組、給藥、取樣及炎癥關鍵指標的檢測取對數生長期細胞于24孔板，分組含：空白對照組、模型組(LPS=100 ng·mL-1)、陽性藥物組(LPS+穿心蓮內酯10 μmol·L-1)、各劑量給藥組(LPS+聯合藥物、LPS+黃芩苷、LPS+小檗堿)，給藥濃度見表1。給藥30 min后除空白孔外每孔加入LPS造模，各平行板LPS分別刺激50 min、4 h、12 h后，吸取培養上清液，用于TNF-α、IL-6、NO的檢測。

取對數生長期細胞于6孔板，同上方各濃度分組操作。分別于LPS刺激2 h、12 h后，提取和變性蛋白，用于p-p65、iNOS的檢測。

按試劑盒說明書操作測定細胞因子水平，通過Western blot檢測蛋白表達水平。

2.3 藥物聯合作用評價Chou-Talalay[4]的中效方程是一種能準確分析藥物配伍使用效果有無協同、拮抗或加和的定量分析法，如實驗數據不呈對數線性關系，以fa/fu值對劑量梯度作圖，可直觀得出結論。本實驗對所得三組fa/fu—劑量關系圖評測，評價二者的聯合作用。

2.4 統計學方法通過SPSS15.0統計軟件對實驗數據進行單因素方差分析，處理組間差異性。

3 結果

3.1 蛋白表達測定結果小檗堿在實驗劑量下呈劑量依賴性地抑制NF-κB的磷酸化 (P<0.05)，對iNOS表達無相關作用；而黃芩苷對NF-κB磷酸化、iNOS表達的抑制作用極微弱；fa/fu—劑量關系圖顯示聯用對NF-κB磷酸化的抑制具有拮抗作用，對iNOS表達的抑制呈現加和作用。

3.2 細胞因子水平測定結果黃芩苷呈劑量依賴性地抑制NO的釋放，最高濃度下對IL-6的釋放具有一定抑制作用(P<0.05 )；小檗堿在實驗劑量下對NO、IL-6的釋放無相關抑制作用；二者對TNF-α均具有微弱的抑制作用；fa/fu—劑量關系圖顯示，二者合用對NO釋放的抑制表現為加和作用，對IL-6、TNF-α釋放的抑制呈現較弱的拮抗作用。

4 討論

黃芩苷和小檗堿在單味藥及復方中均有良好吸收，是發揮療效的主要物質基礎，從二者合用的藥效改變可探索復方的組織機理。本實驗通過相關藥代動力學資料[1,5]確定黃芩苷和小檗堿的摩爾濃度配比為49 ∶1，以反映二者在體內出現的分子比的現實情況，對炎癥通路關鍵節點[6,7]的影響測定發現，黃芩苷和小檗堿聯用對抑制p65磷酸化及TNF-α、IL-6釋放均存在一定拮抗作用，可能由于二者結合導致擴散轉運入胞內的總有效成分降低；更重要的是，兩者合用時小檗堿對抑制NF-κB p65靶點起主導作用，而黃芩苷對抑制IL-6、iNOS及NO釋放起主導作用，提示在復方應用中，黃芩苷和小檗堿并非通過共同干預同一靶標發揮協同作用，而是側重于調控不同靶點，影響不同分子網絡，互補調節炎癥反應從而發揮網絡協同效應，這可能也是中藥組方配伍精髓所在。