黑質(zhì)注射LPS構(gòu)建亞急性帕金森病模型的評價(jià)

劉家岐，趙 明，楚世峰，陳乃宏，張大永

(1.中國藥科大學(xué)藥物科學(xué)研究院，南京 210009；2. 北京醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100730;3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)中心，北京 100050)

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是導(dǎo)致中老年人致死致殘的主要神經(jīng)退行性疾病之一。PD患者常伴有震顫和運(yùn)動遲緩等運(yùn)動癥狀[1]，并以黑質(zhì)處多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元進(jìn)行性變性丟失和黑質(zhì)致密部殘存的神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)路易小體[α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-Syn)為其主要成分]為主要病理特征[2]。帕金森病的發(fā)病機(jī)制有很多，其中神經(jīng)炎癥(主要指小膠質(zhì)細(xì)胞的快速激活)和PD發(fā)病過程之間存在著重要的聯(lián)系[3]。

目前公認(rèn)的研究炎癥機(jī)制最常用的PD模型是脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)動物模型[4]。最初的LPS腹腔注射小鼠模型[5, 6]，因外周注射的LPS不能通過血腦屏障，且并不專一性地刺激黑質(zhì)部位的小膠質(zhì)細(xì)胞，而具有造模周期長，專一性不強(qiáng)等缺點(diǎn)。相比之下，黑質(zhì)部位定位注射LPS就可以特異性地激活黑質(zhì)區(qū)域的小膠質(zhì)細(xì)胞，排除因其他神經(jīng)退行性疾病特征腦區(qū)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活而帶來的干擾。再者，Castao等[7]早在1998年建立的LPS經(jīng)單側(cè)黑質(zhì)誘導(dǎo)的PD大鼠模型中，只觀察了黑質(zhì)內(nèi)DA能神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞的變化，卻缺少對PD標(biāo)志性病理指標(biāo)α-Syn的檢測。

本研究采用腦內(nèi)置管微量給藥系統(tǒng)在雙側(cè)黑質(zhì)連續(xù)5 d注入LPS，建立亞急性PD小鼠模型，發(fā)現(xiàn)該P(yáng)D小鼠模型不僅具備PD樣行為，神經(jīng)炎癥反應(yīng)，而且可模擬PD的病理學(xué)特征，顯著提升中腦內(nèi)α-Syn的單體、寡聚體和磷酸化水平，為從神經(jīng)炎癥解析PD病理學(xué)改變提供了潛在的動物模型，也為炎癥靶點(diǎn)抗PD藥物的研發(fā)奠定了理論的基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動物60只健康的♂ C57/BL小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號：SYXK(京)2014-0023。體質(zhì)量(25～30) g，鼠齡9～10周，清潔級。所有動物飼養(yǎng)于明暗交替的中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所動物房，濕度55%±5%，溫度(22.0±2.0) ℃，實(shí)驗(yàn)過程中自由進(jìn)食飲水。

1.2 試劑LPS(Sigma-Aldrich公司，批號：028M 4094V)、anti-β-actin(Sigma-Aldrich公司)； anti-α-Syn、anti-TH(Santa Cruz 公司); α-Syn 5G4(Millipore 公司)；p-α-Syn(Abcam公司)；HRP 標(biāo)記的二抗(KPL公司)；DAB顯色液(北京中杉金橋)；生理鹽水(四川科倫，批號：M18062105-2)；TRIzol(Invitrogen公司，批號：248201)；氯仿、異丙醇(北京市通廣精細(xì)化工公司，批號:20181015)；TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒(北京全式金，批號：N20426)、TransStart Tip Green qPCR Supermix試劑盒(北京全式金，批號：N10710)；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、ECL超敏發(fā)光液(北京普利萊)。

Fig 1 Scheme of experimental procedure

1.3 儀器與設(shè)備小動物麻醉機(jī)、雙管微量給藥系統(tǒng)、大小鼠腦立體定位儀(深圳瑞沃德)、微量注射泵(保定雷弗流體公司)、冰凍切片機(jī)(Leica公司)、Image Quant LAS 4000 min影像分析儀(GE公司)、臺式冷凍離心機(jī)(Sigma公司)、酶標(biāo)儀(Thermo公司)、大小鼠轉(zhuǎn)棒儀(IITC Life Science公司)、YLS-13A大小鼠拉力測定儀(濟(jì)南益延公司)、LineGene 9600 Plus 熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(杭州博日公司)。

2 方法

2.1 PD小鼠模型制備及分組60只小鼠適應(yīng)1周后開展行為學(xué)訓(xùn)練，剔除掉四肢運(yùn)動不協(xié)調(diào)的小鼠后隨機(jī)分組。空白組，20只，不給予任何處理。模型組，20只，雙側(cè)黑質(zhì)注入溶于生理鹽水的脂多糖溶液(2.5 μg/側(cè))。溶劑組，20只，在腦內(nèi)相同的位點(diǎn)處注入無菌生理鹽水。對溶劑組和模型組的小鼠進(jìn)行異氟烷氣體麻醉后，在黑質(zhì)處植入雙位點(diǎn)的腦內(nèi)導(dǎo)管(AP-3.28 mm,ML-1.50 mm,DV-4.60 mm)，并用牙托水泥固定在顱骨上。埋管結(jié)束休息8 d后，使用5 μL微量注射器通過注射內(nèi)管向模型組小鼠黑質(zhì)內(nèi)注入LPS溶液(每側(cè)2 μL),注射完成后針頭繼續(xù)保持5 min，防止液體溢出而影響模型的建立。LPS溶液連續(xù)給予5 d，每天注射的時間一致。溶劑組以同樣的方法注入無菌的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)進(jìn)程如Fig 1所示。

2.2 行為學(xué)檢測LPS連續(xù)注射5 d后，對各組小鼠進(jìn)行滾軸實(shí)驗(yàn)、爬桿實(shí)驗(yàn)和抓力實(shí)驗(yàn)的行為學(xué)檢測。所有行為學(xué)實(shí)驗(yàn)均置于安靜的動物實(shí)驗(yàn)操作間內(nèi)進(jìn)行。

2.2.1滾軸實(shí)驗(yàn) 將小鼠置于轉(zhuǎn)棒儀上通過小鼠在轉(zhuǎn)棒上的潛伏時間來評價(jià)小鼠的運(yùn)動協(xié)調(diào)能力[8]。參數(shù)設(shè)置為初始速度5 r·min-1，終止速度30 r·min-1，勻加速運(yùn)行5 min。小鼠按照與轉(zhuǎn)棒相反的運(yùn)行方向運(yùn)動，一共測量3次并取平均值來分析，每次間隔30 min以上。

2.2.2爬桿實(shí)驗(yàn) 各組小鼠通過測試其在自制爬桿設(shè)備上的爬下時間來檢測小鼠肢體的協(xié)調(diào)能力[9]。爬桿裝置由纏有紗布的長50 cm直徑1 cm的木桿組成，木桿頂端有一小木球。將自制的爬桿裝置底部與木桿垂直，并放置于大的飼養(yǎng)籠中，底部用墊料覆蓋。記錄各組小鼠3次的爬下時間并取平均值，每次測量間隔30 min以上。

2.2.3抓力實(shí)驗(yàn) 將小鼠抓力測定儀水平放置于實(shí)驗(yàn)操作臺，確保抓力板呈水平方向運(yùn)動。將小鼠輕輕地放在抓力板上，手持小鼠尾部均勻用力后拉，直到小鼠松開前肢，在儀器上記錄下小鼠的抓力。每只小鼠測定6次抓力，并取平均值用于后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析。

2.3 組織樣本及切片制備取每組的10只小鼠麻醉后固定在灌流操作臺上，剪開肋骨，暴露心臟，用灌滿0.01 mol·L-1PBS的注射針頭經(jīng)心臟灌流，剪開右心耳，待肝臟變白后，換為4%的多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)溶液進(jìn)行灌注固定。四肢僵硬后，對小鼠進(jìn)行斷頭取腦，小心地將腦組織剝離至裝有4% PFA溶液的樣本瓶中固定24 h。而后，將小鼠全腦組織用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%、20%、30%的蔗糖PFA溶液進(jìn)行梯度脫水。包埋劑保護(hù)后，將腦組織置于冷凍切片機(jī)內(nèi)進(jìn)行20 μm冠狀切片的制備。每只小鼠的平均地從黑質(zhì)頭側(cè)至尾側(cè)選取30張制備冰凍切片，儲存于-20 ℃冰箱。剩余每組的10只小鼠取中腦和紋狀體組織冷凍于-80 ℃冰箱儲存。

2.4 免疫組織化學(xué)檢測將冰凍切片置于37 ℃烘箱平衡30 min后，浸泡在抗原修復(fù)液內(nèi)熱修復(fù)10 min。冷卻至室溫后，用0.01 mol·L-1PBS溶液洗滌3次，每次5 min。接下來，用1% Triton-100 PBS溶液室溫浸泡10 min。洗滌3次后，用3%的過氧化氫室溫避光孵育10 min。再次洗滌3次，用5%的BSA封閉30 min。封閉液清除后，切片用酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)(1 ∶400)，離子鈣接頭蛋白1(ionized calcium binding adapter molecule-1，IBA-1) (1 ∶200) 的一抗4 ℃孵育過夜。PBST緩沖液洗滌3次后，滴加用辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h。再次洗滌3次后，使用DAB顯色試劑盒顯色。切片梯度酒精脫水后，在二甲苯 Ⅰ(Ⅱ)中各浸泡5 min，在切片上滴加中性樹脂封片。在顯微鏡下觀察，拍攝代表性的圖片，用Image pro Plus6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

Fig 2 Behavioral results of three groups of mice

A: Rotarod test:the latent time.B: Pole test: the climbing down time. C:Grip strength test: the grip strength.##P<0.01vsvehicle group

2.5 實(shí)時定量PCR分析使用TRIzol從中腦組織中提取總RNA，用Nano核酸定量儀測定RNA的濃度及純度。使用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒將RNA全部逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用TransStart Tip Green qPCR Supermix試劑盒將1 μg RNA合成的cDNA用AB 7900HT快速實(shí)時定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行cDNA的擴(kuò)增。并采用ΔΔCT的相對定量方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每種目標(biāo)基因的引物見Tab 1。

Tab 1 Primers for qPCR analysis

2.6 蛋白免疫印跡分析使用RIPA裂解液從中腦組織中提取出蛋白上清，并用BCA試劑測定濃度。采用SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)(每個30 μg),轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。PVDF膜用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的 BSA室溫封閉2 h后，孵育一抗4 ℃冰箱中過夜：抗α-synuclein (1 ∶200),抗α-synuclein(5G4)(1 ∶1 000)，抗磷酸化α-synuclein(1 ∶500)和內(nèi)參β-actin(1 ∶1 000)。TBST緩沖液洗滌3次后，室溫孵育各自條帶對應(yīng)的二抗2 h。洗滌3次后，室溫孵育三抗(1 ∶5 000)1 h。再次洗滌3次后，用ECL發(fā)光試劑盒將膜條帶化學(xué)曝光并用影像分析儀掃描記錄圖像。用Image J軟件進(jìn)行進(jìn)一步的條帶定量分析。

靶向抗腫瘤單克隆抗體類藥物聯(lián)合常規(guī)化療方案治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的臨床進(jìn)展 ………………………… 趙源浩（14）：2012

3 結(jié)果

3.1 雙側(cè)黑質(zhì)注射LPS可誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)PD樣行為學(xué)障礙靜止性震顫是PD典型的運(yùn)動障礙，在小鼠上表現(xiàn)為運(yùn)動協(xié)調(diào)性的降低。如Fig 2所示，在滾軸實(shí)驗(yàn)中，與溶劑組相比，模型組小鼠在滾軸上的潛伏時間顯著縮短(P<0.01)，從爬桿頂端到底端的用時顯著延長(P<0.01)和基礎(chǔ)抓力明顯變小(P<0.01)。與空白組相比，溶劑組小鼠的潛伏時間、爬下時長和基礎(chǔ)抓力無顯著的變化，表明本實(shí)驗(yàn)的造模方法對小鼠不產(chǎn)生行為學(xué)的改變。

3.2 雙側(cè)黑質(zhì)注射LPS誘導(dǎo)小鼠黑質(zhì)DA能神經(jīng)元受損為了確定小鼠的整個黑質(zhì)中DA能神經(jīng)元丟失的程度和模式，對溶劑組和模型組中各一只小鼠的30張黑質(zhì)切片進(jìn)行全部免疫組化染色，計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)每一張黑質(zhì)切片中DA能神經(jīng)元的數(shù)目。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如Fig 3所示。因此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，我們選取30張切片中的第10到第15張黑質(zhì)切片進(jìn)行染色分析。

如Fig 4所示，模型組小鼠黑質(zhì)致密部的DA能神經(jīng)元的數(shù)目對比溶劑組顯著減少，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。溶劑組黑質(zhì)處多巴胺能神經(jīng)元的個數(shù)與空白組的數(shù)目相近，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

Fig 3 Quantitative analysis of LPS-induced loss

Thirty coronal sections from rostral to caudal were taken from brains injected intranigrally with saline (2 μL) or LPS (2 μL; 5 days) and immunostained with an anti-TH antibody. The number of TH-positive neurons in the SN was visually counted under a microscope. The results shown are from one representative set of sections from one brain, and similar results were obtained with sections from two other brains.

Fig 4 Effect of LPS on TH expression in midbrain

A:Representative photomicrograph of TH-immunoreactive neurons across groups. (scale bar = 400 μm) B: A histogram representing the quantitative analysis of TH-positive cells normalized to control levels is shown.##P<0.01vsvehicle group

Fig 5 Effect of LPS on activation state of microglia

A: Representative photomicrograph of IBA-1-immunoreactive cells across groups. (scale bar=400 μm) B: A histogram representing the quantitative analysis of IBA-1-positive cells normalized to control levels is shown.##P<0.01vsvehicle group

3.3 雙側(cè)黑質(zhì)注射LPS可誘導(dǎo)小鼠黑質(zhì)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活小膠質(zhì)細(xì)胞是介導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)過程中起著非常重要作用的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。如Fig 5所示，LPS的暴露造成了模型組小鼠黑質(zhì)部位的小膠質(zhì)細(xì)胞大量激活。與溶劑組相比，模型組小鼠黑質(zhì)區(qū)域IBA-1免疫陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目顯著增加(P<0.01),且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而溶劑組小鼠黑質(zhì)IBA-1免疫陽性小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目對比空白組，無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3.4 雙側(cè)黑質(zhì)注射LPS可誘導(dǎo)小鼠中腦內(nèi)炎癥因子mRNA的表達(dá)上調(diào)我們運(yùn)用實(shí)時定量PCR技術(shù)觀察小鼠中腦內(nèi)促炎性細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)變化。如Fig 6所示，和溶劑組相比，LPS炎癥PD模型小鼠中腦內(nèi)炎癥因子TNF-α (P<0.01)和IL-1β (P<0.01)的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào),且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同樣，溶劑組小鼠中腦內(nèi)炎癥因子的表達(dá)水平與空白組無顯著的差異。

3.5 雙側(cè)黑質(zhì)注射LPS可誘導(dǎo)小鼠中腦內(nèi)不同形式的α-Syn表達(dá)增加如Fig 7A和7B所示，我們采用Westernblot 方法檢測了單體形式的 α-Syn、寡聚體形式的α-Syn(5G4)和磷酸化形式的 α-Syn(Ser129)在小鼠黑質(zhì)部位的表達(dá)。和溶劑組相比，模型組小鼠黑質(zhì)部位單體形式的α-Syn的蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.01)。同樣地，LPS的作用使小鼠黑質(zhì)部位磷酸化形式的α-Syn表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)。接下來，我們進(jìn)一步用α-Syn(5G4)來更全面地檢測小鼠黑質(zhì)部位中的α-Syn。如Fig 7C所示，模型組小鼠黑質(zhì)部位的聚集化的α-Syn表達(dá)增加，與溶劑組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。而溶劑組小鼠中腦內(nèi)單體形式、寡聚體形式和磷酸化形式的α-Syn的表達(dá)水平與空白組相比差異無顯著性。

Fig 6 Effect of LPS on mRNA expression of TNF-α and

A: TNF-α; B: IL-1β. The relative mRNA level was normalized to GAPDH mRNA.##P<0.01vsvehicle group

4 討論

本次研究中，考慮到多次連續(xù)定位注射LPS至小鼠的黑質(zhì)，容易因機(jī)械手術(shù)損傷而增加死亡率，于是我們引入了雙位點(diǎn)腦內(nèi)置管微量給藥系統(tǒng)，對傳統(tǒng)的LPS大鼠模型建立方法進(jìn)行了優(yōu)化改進(jìn)[10]，大大降低了連續(xù)多次黑質(zhì)處注射造成的死亡率，也減少了連續(xù)多次的注射位點(diǎn)誤差。

在本次的研究結(jié)果中，行為學(xué)結(jié)果顯示，LPS模型組小鼠的滾軸潛伏期顯著縮短、爬下時間延長和前肢的抓力顯著下降，表明LPS造模后的小鼠運(yùn)動協(xié)調(diào)性差、運(yùn)動變遲緩和肌肉張力下降。同時，模型組小鼠表現(xiàn)出肢體僵硬、姿態(tài)不穩(wěn)及一些震顫的跡象，與PD患者的臨床運(yùn)動癥狀相符[11]。

本實(shí)驗(yàn)的病理學(xué)結(jié)果同樣也表明，模型組小鼠黑質(zhì)致密部的DA能神經(jīng)元受損嚴(yán)重、大量小膠質(zhì)細(xì)胞激活和黑質(zhì)內(nèi)炎癥因子mRNA的水平上調(diào)顯著。在LPS經(jīng)黑質(zhì)注射的大鼠模型的研究中，Castao等[7]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)LPS可以造成大鼠黑質(zhì)部位多巴胺能神經(jīng)元的不可逆性損毀。大多數(shù)PD病人的尸檢結(jié)果也已經(jīng)表明[12]，患者腦內(nèi)存在大量的激活態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞。小膠質(zhì)細(xì)胞是介導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)的膠質(zhì)細(xì)胞中重要的組成部分，對其激活狀態(tài)的檢測有助于判斷LPS是否在小鼠黑質(zhì)處產(chǎn)生炎癥[13]。而其分泌的TNF-α和 IL-1β 等致炎性細(xì)胞因子可以導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元的變性，是神經(jīng)炎癥造成PD樣病理表現(xiàn)的重要機(jī)制。因此，本亞急性PD小鼠的病理結(jié)果與PD患者的尸檢結(jié)果相符,此炎癥PD模型建立成功。

在PD的病因探究過程中，Spillantini等[14]在1997年最先在PD患者腦內(nèi)觀察到α-Syn這種神經(jīng)元蛋白。并且目前普遍認(rèn)為 α-Syn是PD的重要病理及診斷特征的重要蛋白標(biāo)志，它的異常聚集與PD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。針對α-Syn三種不同的形式，我們運(yùn)用相應(yīng)的抗體對三組小鼠黑質(zhì)部位的α-Syn進(jìn)行了檢測。蛋白免疫印跡結(jié)果表明，LPS經(jīng)黑質(zhì)誘導(dǎo)的小鼠中腦內(nèi)單體形式、寡聚體形式和磷酸化形式的α-Syn的蛋白表達(dá)水平增加。且已有文獻(xiàn)報(bào)道[15]，磷酸化α-Syn水平增加可以引起DA能神經(jīng)元的毒性損傷。因此，本次建立的LPS亞急性PD小鼠模型不僅成功模擬了PD樣的行為學(xué)障礙和炎癥相關(guān)的PD病理學(xué)改變。更是觀察到模型組小鼠在PD典型腦區(qū)黑質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)α-Syn的聚集和異常改變等PD的診斷性指標(biāo)，使此亞急性PD模型的專一性更強(qiáng)，此炎癥PD模型的建立更具意義。

綜上所述，LPS經(jīng)黑質(zhì)誘導(dǎo)的小鼠可以出現(xiàn)PD樣運(yùn)動障礙，PD樣病理表現(xiàn)和PD診斷標(biāo)志蛋白。此神經(jīng)炎癥的亞急性PD小鼠模型模型持續(xù)、穩(wěn)定且造模時間短，為抗PD新藥的臨床前篩選提供了新途徑，也為PD免疫炎癥發(fā)病機(jī)制的探究過程中轉(zhuǎn)基因小鼠的使用奠定了基礎(chǔ)。

Fig 7 Effects of LPS on α-synuclein expression in midbrain of

A: Representative protein bands of α-synuclein detected by α-synuclein and β-actin and a histogram representing the quantitative analysis of α-synuclein levels normalized to β-actin protein levels are shown. B: Representative protein bands of α-synuclein detected by p-α-synuclein and β-actin and a histogram representing the quantitative analysis of p-α-synuclein levels normalized to β-actin protein levels are shown. C: Representative protein bands of α-synuclein detected by α-synuclein(5G4) and β-actin and a histogram representing the quantitative analysis of α-synuclein(5G4) levels normalized to β-actin protein levels are shown.##P<0.01vsvehicle group