孕酮對Aβ所致星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥小體表達(dá)的影響及機制研究

洪 洋，王明霞，夏龍飛，劉運江

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院1.臨床藥理研究部、2. 檢驗科東、3. 乳腺中心，石家莊 050000)

阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease，AD)又稱老年癡呆，是以記憶和認(rèn)知功能障礙為主要特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變[1]。最近研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)炎癥反應(yīng)在AD病理學(xué)發(fā)展方面起到了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[2]。值得注意的是，在AD患者的大腦皮層和皮層下結(jié)構(gòu)出現(xiàn)大量異常活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞。這些活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞聚集于AD患者腦內(nèi)淀粉樣蛋白和神經(jīng)纖維纏結(jié)周圍，并產(chǎn)生促炎癥調(diào)節(jié)因子。這已經(jīng)構(gòu)成了AD發(fā)病早期出現(xiàn)的重要病理學(xué)現(xiàn)象[3]。這就提示我們，調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞功能可能成為治療大腦神經(jīng)炎癥反應(yīng)的重要靶點。

近期大量的研究證實，神經(jīng)甾體孕酮(progesterone，PG)具有顯著的神經(jīng)保護性作用，尤其在調(diào)節(jié)AD認(rèn)知功能方面表現(xiàn)出獨特的作用[4,5]。研究組前期發(fā)現(xiàn)，在AD模型大鼠腦內(nèi)PG分泌水平顯著降低，當(dāng)給予PG體內(nèi)干預(yù)后AD大鼠認(rèn)知功能得到明顯改善[6]。然而，關(guān)于PG神經(jīng)保護機制的探討尚未完全闡明，其中PG對于腦神經(jīng)炎癥反應(yīng)的調(diào)控機制尚不清楚，NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor proteins 3，NLRP3)炎癥小體所介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)分子機制還需要進一步探索。因此，本文旨在研究PG對于Aβ誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞異常活化的調(diào)節(jié)作用，探索誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體活化可能分子機制，為PG改善AD早期大范圍神經(jīng)炎癥反應(yīng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器新生SD鼠，清潔級，河北省實驗動物中心提供[許可證號:SCXK(冀)2008-1003]；神經(jīng)甾體PG、Aβ1-42片段，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑Salubrinal (Sal)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進劑Tunicamycin (TM)均購置美國Sigma公司(St. Louis,MO,USA)，DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清FBS購置Gibco (Carlsbad,CA,USA)，NLRP3、pro-IL-1β、β-actin抗體購置Cell Signaling 公司 (Beverly,MA,USA)。羊抗兔/FITC多克隆抗體購置Bioss公司(Beijing,China)。

1.2 原代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞來源于新生SD大鼠大腦皮層，無菌條件下破碎組織，制備單細(xì)胞懸液，37 ℃，5% CO2條件下孵育培養(yǎng)，每2 d更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞充分覆蓋后，37 ℃震蕩去除多余小膠質(zhì)細(xì)胞，應(yīng)用免疫熒光染色鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞純度(純度>95%)，純化后的細(xì)胞分別接種于細(xì)胞培養(yǎng)板(用于ELISA、Immofluorescence、Western blot試驗)。

1.3 ELISA檢測取正常培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)過干預(yù)處理后，應(yīng)用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞上清IL-1β的分泌水平改變。首先，建立0～1 000 ng·L-1標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后取上清100 μL加入到預(yù)先孵育抗IL-1β培養(yǎng)板內(nèi)。根據(jù)試劑盒說明書要求，分別要求依次加入檢測試劑。最后應(yīng)用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測細(xì)胞上清IL-1β濃度。

1.4 Western blot檢測取星形膠質(zhì)細(xì)胞裂解后提取總蛋白，BCA蛋白試劑盒計算蛋白含量，提取蛋白，分別制備10%或15% SDS分離膠分離蛋白，并通過半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜。PVDF膜應(yīng)用5%脫脂奶粉封閉，4 ℃分別孵育pro-IL-1β和NLRP3抗體過夜，室溫孵育二抗2 h，ECL光化學(xué)顯色。最后應(yīng)用Image J分析軟件對掃描條帶進行定量分析。

1.5 免疫熒光檢測取4%甲醛固定星形膠質(zhì)細(xì)胞，0.05% Triton X-100和3% BSA封閉打孔，4 ℃分別孵育NLRP3抗體過夜，室溫孵育二抗2 h，DAPI進行核染色，應(yīng)用熒光顯微鏡檢測細(xì)胞。

1.6 藥物干預(yù)與分組取正常培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，隨機分為對照組、Aβ組(5 μmol·L-1)、TM組(5 μmol·L-1)、PG保護組(1 μmol·L-1)、Sal處理組(10 μmol·L-1)。Aβ組給予多聚化Aβ1-42干預(yù)6 h；TM處理組應(yīng)用TM干預(yù)處理2 h；PG保護組給予PG和TM或Aβ共同處理6 h；Sal處理組應(yīng)用Sal預(yù)處理1 h，然后與PG、Aβ共處理6 h。對照組給予DMEM培養(yǎng)基對照處理。

2 結(jié)果

2.1 PG抑制Aβ誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3表達(dá)活化如Fig 1免疫熒光結(jié)果所示，與對照組相比較，Aβ干預(yù)處理6 h，在星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)炎癥小體NLRP3出現(xiàn)了大量聚集，在胞質(zhì)和胞核附近均出現(xiàn)明顯表達(dá)；相比Aβ組，PG明顯抑制了Aβ所致星形膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3的大量表達(dá)。

Fig 1 Aβ-induced NLRP3 inflammasome activation

Left picture was control group,middle picture was Aβ-treated group,right picture was PG-treated group; NLRP3 was stained green,nucleus was stained blue,scale bar=20 μm

2.2 PG通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制Aβ誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β分泌如Fig 2 ELISA結(jié)果所示，相比對照組，Aβ組和TM組IL-1β分泌水平均出現(xiàn)明顯增加(P<0.01)；相比Aβ組和TM組，PG明顯抑制IL-1β分泌水平增加(P<0.01)。

Fig 2 Aβ-induced IL-1β secretion via regulating ER stress

**P<0.01vsAβ-treated group,##P<0.01vsTM-treated group

2.3 PG通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制Aβ誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞pro-IL-1β表達(dá)如Fig 3 Western blot結(jié)果所示，相比對照組，Aβ和TM均促進了星形膠質(zhì)細(xì)胞pro-IL-1β表達(dá)(P<0.05)。相比Aβ組和TM組，PG明顯抑制Aβ或TM所致pro-IL-1β表達(dá)水平增加(P<0.05)。研究結(jié)果表明，PG能通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激活化降低星形膠質(zhì)細(xì)胞成熟型pro-IL-1β片段的形成。

Fig 3 Aβ-induced pro-IL-1β expression via regulating ER

*P<0.05 vs Aβ-treated group,#P<0.05vsTM-treated group

2.4 PG通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制Aβ所致星形膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3表達(dá)活化如Fig 4 Western blot結(jié)果所示，相比對照組，Aβ組明顯促進星形膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3表達(dá)活化(P<0.05)。相比Aβ組，PG明顯抑制NLRP3表達(dá)水平的增加(P<0.05)。相比于PG保護組，Sal明顯性阻斷PG對于 Aβ所誘導(dǎo)NLRP3表達(dá)的抑制作用(P<0.05)。研究結(jié)果說明，PG通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激活化抑制Aβ所致星形膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3表達(dá)增加。

Fig 4 Aβ-induced NLRP3 expression via regulating ER

*P<0.05vsAβ-treated group,#P<0.05vsPG-treated group

3 討論

隨著AD致病機制的深入研究，神經(jīng)炎癥反應(yīng)作為AD重要的病理學(xué)特征之一逐漸受到研究者的廣泛關(guān)注[7]。研究發(fā)現(xiàn)，AD患者的大腦皮層和皮層下結(jié)構(gòu)存在廣泛的膠質(zhì)細(xì)胞活化，且伴隨著大范圍炎癥反應(yīng)發(fā)生。這已經(jīng)構(gòu)成AD早期出現(xiàn)的重要病理學(xué)改變。因此，減少Aβ所引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞功能損傷可能成為降低其所誘發(fā)的大范圍神經(jīng)炎癥反應(yīng)的重要防治策略之一。IL-1β常常被看作是一個“疾病因子”，對腦海馬依賴的記憶功能表現(xiàn)出持續(xù)的影響[8]。然而，IL-1β的成熟和分泌需要NLRP3炎癥小體活化的參與。研究顯示，NLRP3炎癥小體活化以及其所介導(dǎo)的促炎癥反應(yīng)信號通路對于調(diào)節(jié)AD損傷方面表現(xiàn)出明顯作用[9]。我們研究發(fā)現(xiàn)，Aβ能夠誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體在星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)大量活化表達(dá)。因此，為了解決AD治療的重要問題，亟待開發(fā)抑制NLRP3炎癥小體表達(dá)活化有效藥物并闡明可能的調(diào)控機制。

神經(jīng)甾體PG作為重要的內(nèi)源性神經(jīng)活性甾體化合物，在調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞功能方面發(fā)揮著重要作用，特別是對改善AD方面發(fā)揮著潛在的治療功能[6]。但是，PG對于AD的神經(jīng)保護機制尚未完全闡明。目前大量研究發(fā)現(xiàn)，PG在調(diào)節(jié)腦缺血和腦損傷方面表現(xiàn)出顯著的神經(jīng)保護性作用，特別是在促進神經(jīng)元存活，抑制神經(jīng)元凋亡等方面作用明顯[5,10]。然而，關(guān)于PG對于神經(jīng)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用研究較少。我們首先評估神經(jīng)甾體PG對于NLRP3炎癥小體表達(dá)的影響，研究發(fā)現(xiàn)，PG能夠顯著性的抑制Aβ所致的星形膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3表達(dá)，并降低Aβ所誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)IL-1β、pro-IL-1β的合成分泌。盡管PG對于NLRP3炎癥小體在細(xì)胞分子內(nèi)的調(diào)控機制尚未完全闡明，但是可以肯定的是，在溶酶體損傷[11]、線粒體鈣離子通量改變[12]，以及氧化應(yīng)激片段ROS形成[13]等應(yīng)激條件下能明顯激活細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎癥信號。為了證實上述假設(shè)，我們應(yīng)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑TM或Aβ干預(yù)星形膠質(zhì)細(xì)胞，然后給予PG處理后發(fā)現(xiàn)，PG能夠明顯抑制TM或Aβ所致IL-1β、pro-IL-1β分泌以及NLRP3的表達(dá)合成。與之相反，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑Sal顯著阻斷了PG對于Aβ所致NLRP3表達(dá)的抑制作用。在一定程度說明了PG對于AD的神經(jīng)保護性作用，特別是對于NLRP3相關(guān)神經(jīng)炎癥反應(yīng)的抑制作用，并在調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)AD功能損傷方面存在潛在的聯(lián)系[14]。該研究結(jié)果表明， NLRP3炎癥小體可能成為神經(jīng)甾體PG對于AD治療的一個潛在的分子調(diào)控靶點。

綜上所述，本研究闡明了神經(jīng)甾體PG對于Aβ所致星形膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體活化的神經(jīng)保護性機制，并建立了Aβ所致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激活化與星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥反應(yīng)的潛在聯(lián)系，進一步加深我們對于AD致病機制的認(rèn)識，為AD的臨床治療提供新的治療思路。