裂果薯皂苷單體Ⅰ通過TGF-β1調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721侵襲和轉(zhuǎn)移的影響

呂美嫻，廖智紅，周 歡，周金玲，甘日植，朱洪卿，章璇璇，梁 鋼

(1. 廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021；2. 崇左市人民醫(yī)院，藥學(xué)部，廣西 崇左 532200)

肝癌是一種高致死率的惡性腫瘤，有易耐藥、易轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)。肝癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移也是術(shù)后復(fù)發(fā)致死的主要原因。因此，抑制肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移是治療肝癌的關(guān)鍵問題。

肝癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、多因素相互作用的復(fù)雜過程[1，2]。肝癌細(xì)胞從原發(fā)部位浸潤(rùn)，破壞周圍正常組織，進(jìn)入血液循環(huán)完成侵襲過程，然后隨著血液遷移到其他組織器官，進(jìn)一步發(fā)展成繼發(fā)性癌灶是肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程。因此，抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是貫穿腫瘤惡性發(fā)展的重要步驟，同時(shí)也成為了抗肝癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是一種具有多種生物學(xué)活性的生物因子,參與細(xì)胞的增殖、侵襲等過程[3，4]。Smad家族蛋白是TGF-β1/Smad信號(hào)通路的底物蛋白，是將 TGF-β1信號(hào)從細(xì)胞外轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)的重要蛋白因子。SIS3作為Smad蛋白抑制劑，通過抑制TGF-β1/ Smad信號(hào)通路的下游蛋白，從而阻斷TGF-β1/ Smad信號(hào)通路活性。馬艷等[5]報(bào)道，TGF-β1可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。EMT指上皮細(xì)胞和周圍間質(zhì)互相作用過程中獲得的某些間質(zhì)細(xì)胞特有表型的現(xiàn)象,目前被認(rèn)為是癌細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵啟動(dòng)步驟[6]，能夠使細(xì)胞的侵襲及遷移能力增強(qiáng)。因而，抑制癌細(xì)胞發(fā)生EMT，有利于控制肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。

目前，尋找新型抗人肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的藥物或天然活性物已成為提高肝癌治療水平和改善其預(yù)后是研究的熱點(diǎn)。中藥裂果薯是一種廣西特色的中草藥，屬壯、瑤藥，其拉丁名為：SchizocapsaplantagineaHance。裂果薯皂苷單體I(Saponin monomer I ofSchizocapsaplantagineaHance，SSPH Ⅰ)是從該植物中提取分離得到的甾體皂苷單體之一[7]。本項(xiàng)目組前期通過活性追蹤，發(fā)現(xiàn)SSPH Ⅰ對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖、遷移有明顯的抑制作用[8，9]，但是其抗肝癌細(xì)胞侵襲遷移是否與TGF-β1/Smad通路有關(guān)尚未見相關(guān)報(bào)道。為此，本文將通過體外人肝癌細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，探討SSPH Ⅰ能否通過TGF-β1/Smad調(diào)控EMT發(fā)揮抗人肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用。旨在解決目前抗肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移情況的難點(diǎn)問題，同時(shí)為SSPH Ⅰ作為抗肝癌新藥研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物裂果薯塊莖購(gòu)自廣西壯族自治區(qū)資源縣瓜里鄉(xiāng)，并由廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院黃云峰教授鑒定為SchizocapsaplantagineaHance,裂果薯皂苷單體I(Saponin monomer I ofSchizocapsaplantagineaHance，SSPH Ⅰ)由本課題組提取與鑒定。取0.97 mg的SSPH Ⅰ粉末，加入970 μL的DMSO，制成970 μmol·L-1母液，4 ℃保存?zhèn)溆?，正式?shí)驗(yàn)中用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成相應(yīng)濃度備用。

1.2 細(xì)胞系SMMC-7721人肝癌細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)并由本課題組傳代培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)以10 μg·L-1的TGF-β1誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生EMT，以10 μmol·L-1的SIS3阻斷TGF-β1/Smad信號(hào)通路，以此作為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)分為6組：空白對(duì)照組、TGF-β1對(duì)照組、TGF-β1聯(lián)合SIS3組、TGF-β1聯(lián)合不同濃度的SSPH Ⅰ給藥組。

1.4 試劑胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，貨號(hào)：11011-8611)；0.25%胰酶消化液、青-鏈霉素混合液、磷酸鹽(PBS)緩沖液、MTT、二甲基亞砜(DMSO)(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)T1300-100；P1400-100；P1020-500；M8180；D8370)；DMEM高糖培養(yǎng)基(HyClone 公司，貨號(hào)：C11995500BT)；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒 ( 碧云天生物科技有限公司,貨號(hào)：P0010S) ；GAPDH抗體,重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1,Smad7抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：10494-1-AP；10804-HNAC；25840-1-AP)；E-cadherin，N-cadherin,Vimentin，Smad2/3，p-Smad2/3抗體，HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG(美國(guó)CST公司，貨號(hào)：3195T、13116T、5741T、5678S、8828S、5151P)。

1.5 儀器酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，二氧化碳孵箱( 美國(guó)Thermo Fisher scientific 公司) ; 超凈工作臺(tái)( 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司) ; 熒光倒置顯微鏡(日本OLYMPUS 公司); 電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀 (北京六一生物科技有限公司) 。

1.6 實(shí)驗(yàn)方法

1.6.1MTT法檢測(cè)SSPH Ⅰ對(duì)細(xì)胞增殖的影響 將SMMC-7721細(xì)胞用0.25%胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)·mL-1，接種于96孔板中，每孔100 μL，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，共10組。培養(yǎng)箱中孵育至細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%時(shí)，棄去培養(yǎng)基，加入不同濃度的SSPH Ⅰ(0.06、0.12、0.24、0.49、0.97、1.94、3.88、7.76、15.52 μmol·L-1)，每孔100μL，孵育24 h后，每孔加入0.5 g·L-1的MTT溶液各100 μL孵育4 h，棄去MTT溶液，每孔加入100 μL DMSO，搖床上振搖15 min，在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)其OD值。細(xì)胞抑制率/%=(空白組平均值-給藥組平均值)/空白組平均值×100%。以細(xì)胞增殖抑制率與給藥濃度作圖，求出IC50。

1.6.2劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SSPH Ⅰ對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響 制備單細(xì)胞懸液(1×106·mL-1)，每孔100 μL接種于96孔板中，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%后，用10 μg·L-1的TGF-β1刺激細(xì)胞24 h。200 μL的槍頭于正中央劃痕，每孔一道，PBS洗3遍，輕輕吹打下散落的細(xì)胞。以給完藥時(shí)刻作為0 h，設(shè)置拍照時(shí)間為0、24、48 h，固定同一個(gè)視野進(jìn)行拍照。利用Image J軟件統(tǒng)計(jì)各組劃痕寬度。24 h細(xì)胞遷移率/%=|(24 h劃痕寬度-0 h劃痕寬度)|/0 h劃痕寬度×100%，48 h細(xì)胞遷移率/%=|(48 h劃痕寬度-0 h劃痕寬度)|/0 h劃痕寬度×100%。

1.6.3Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SSPH Ⅰ對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響 Matrigel基質(zhì)膠與無(wú)血清的培養(yǎng)基1 ∶4混合稀釋，每孔50 μL加入小室內(nèi)，培養(yǎng)箱中溫育1 h至基質(zhì)膠凝固。將SMMC-7721單細(xì)胞懸液(1×107·mL-1)以每孔100 μL接種于小室上室中，每孔100 μL的SSPH Ⅰ藥液與細(xì)胞懸液混合置于上室。下室加入800 μL含20%血清的培養(yǎng)基，孵育24 h，棄去培養(yǎng)基，PBS洗2遍，小室放入冰甲醇中固定30 min，PBS洗2～3遍，待膜完全風(fēng)干后放入有800 μL 0.1%的結(jié)晶紫溶液中，染色30 min。PBS洗2～3遍，風(fēng)干，然后取4個(gè)視野，20×顯微鏡下拍照，觀察SSPH Ⅰ對(duì)細(xì)胞侵襲能力影響的情況。

1.6.4Western blot實(shí)驗(yàn) 以RIPA ∶PMSF ∶磷酸化抑制劑=100 ∶1 ∶1的比例配制蛋白裂解液，每孔100 μL收集細(xì)胞，冰上裂解15 min后13 000 r·min-1離心20 min,收集上清液。用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，加蛋白上樣緩沖液制樣，100 ℃沸水中加熱5 min使蛋白變性。按照每個(gè)泳道100 μg的蛋白量進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜。TBST洗膜3次，每次5 min。Smad7、Smad2/3、p-Smad2/3、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin一抗于4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次5 min。室溫下二抗孵育1 h。最后用近紅外雙色成像系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 SSPH Ⅰ抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SSPH Ⅰ抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖(Fig 1)。在24 h的IC50為1.72 μmol·L-1，可見SSPH Ⅰ對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖有明顯抑制作用(P<0.01)。為了更好的觀察SSPH Ⅰ對(duì)SMMC-7721細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響，選擇0.73、1.46、2.92 μmol·L-1這3個(gè)濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 SSPH Ⅰ抑制SMMC-7721細(xì)胞遷移細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示(Fig 2A)，隨著SSPH Ⅰ濃度的增加，TGF-β1+SSPH Ⅰ組細(xì)胞遷移率降低。Control組、TGF-β1組、TGF-β1+SIS3組、TGF-β1+SSPH Ⅰ(0.73、1.46、2.92 μmol·L-1)組24 h細(xì)胞遷移率分別為(19.09±3.72)%、(27.1±4.84)%、(8.32±1.6)%、(6.89±3.29)%、(6.09±2.28)%、(5.01±2.98)%。48小時(shí)細(xì)胞遷移率分別為(30.48±8.94)%、(44.74±10.02)%、(5.51±2.91)%、(9.05±5.24)%、 (8.35±1.73)%、(11.86±3.95)%。與Control組相比，24 h和48 h的TGF-β 1組細(xì)胞遷移率明顯升高(P<0.05)，說明TGF-β1促進(jìn)細(xì)胞遷移。與TGF-β1組相比(Fig 2B,C)，TGF-β1+SSPH Ⅰ組24 h和48 h的細(xì)胞遷移率明顯降低(P<0.01)。與TGF-β1+SIS3組結(jié)果相同。

2.3 SSPH Ⅰ抑制SMMC-7721細(xì)胞侵襲Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(Fig 3A)，SSPH Ⅰ明顯抑制SMMC-7721細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Control組、TGF-β1組、TGF-β1+SIS3組、TGF-β1+SSPH Ⅰ(0.73、1.46、2.92 μmol·L-1)組的細(xì)胞侵襲數(shù)分別是219±55、277±48、94±30、116±39、83±40、23±14個(gè)(Fig 3B)。與Control組相比，TGF-β1組穿過基質(zhì)膠與濾膜侵襲入下室的SMMC-7721細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.05)。與TGF-β1組相比，TGF-β1+SSPH Ⅰ組的侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.01)。與TGF-β1+SIS3組結(jié)果相同。

Fig 1 Effect of SSPH Ⅰ on proliferation of

**P<0.01vscontrol

Fig 2 Effect of SSPH Ⅰ on migration of SMMC-7721

A： The result of cell scratch assay；B： The cell migration rate of 24 h；C.The cell migration rate of 48 h；1：Control；2：TGF-β1；3：TGF-β1+SIS3；4：TGF-β1+SSPH Ⅰ 0.73 μmol·L-1；5：TGF-β1+SSPH Ⅰ 1.46 μmol·L-1；6：TGF-β1+SSPH Ⅰ 2.92 μmol·L-1(ΔP<0.05vscontrol,**P<0.01vsTGF-β1)

Fig 3 Effect of SSPH Ⅰ on invasion of

A：The result of Transwell assay； B：The number of cell invasion;1：Control；2：TGF-β1；3：TGF-β1+SIS3；4：TGF-β1+SSPH Ⅰ 0.73 μmol·L-1；5：TGF-β1+SSPH Ⅰ 1.46 μmol·L-1；6：TGF-β1+SSPH Ⅰ 2.92 μmol·L-1.(△P<0.05vscontrol,**P<0.01vsTGF-β1)

2.4 SSPH Ⅰ抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路和EMTWestern blot結(jié)果顯示，與Control組相比較，TGF-β1組E-cadherin蛋白表達(dá)降低，N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。說明TGF-β1誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生EMT(Fig5A)。同時(shí)，TGF-β1組p-Smad2/3蛋白表達(dá)增加(P<0.05)，Smad7蛋白表達(dá)降低(P<0.01)?？梢奣GF-β1通過激活TGF-β1/Smad信號(hào)通路而發(fā)揮作用(Fig 4A)。與TGF-β1組相比，TGF-β1+SSPH Ⅰ組N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)降低(Fig 5B)，E-cadherin蛋白表達(dá)增加(Fig 5B)，此外p-Smad2/3蛋白表達(dá)降低(Fig 4B)，Smad7蛋白表達(dá)增加(Fig 4B)。結(jié)果與TGF-β1+SIS3組相同(P均<0.05)。說明SSPH Ⅰ通過阻斷TGF-β1/Smad信號(hào)通路，抑制EMT的發(fā)生。

Fig 4 Effect of SSPH Ⅰ on TGF-β1/Smad signaling

A. The effect of SSPH Ⅰ on key proteins of TGF-β1/Smad signaling pathway；B.The result of relative protein expressionof TGF-β1/Smad signaling pathway;1：Control；2：TGF-β1；3：TGF-β1+SIS3；4：TGF-β1+SSPH Ⅰ 0.73 μmol·L-1；5：TGF-β1+SSPH Ⅰ 1.46 μmol·L-1；6：TGF-β1+SSPH Ⅰ 2.92 μmol·L-1.(△P<0.05,△△P<0.01vscontrol,**P<0.01vsTGF-β1)

3 討論

原發(fā)性肝癌主要以肝細(xì)胞癌( hepatocellular carcinoma，HCC) 為主，是一種常見的高致死率的惡性腫瘤。肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是其一個(gè)重要的生物學(xué)特性。也是術(shù)后復(fù)發(fā)致死的主要原因。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)是反映腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，TGF-β1組的細(xì)胞遷移率和侵襲數(shù)量較Control組明顯增加，但這一作用被SSPH Ⅰ明顯抑制，可見，SSPH Ⅰ能抑制SMMC-7721細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移,其機(jī)制可能與抑制TGF-β1的生物學(xué)作用有關(guān)。

Fig 5 Effect of SSPH Ⅰ on EMT SMMC-7721

A. The effect of SSPH Ⅰ on EMT；B.The result of relative protein expression of EMT;1：Control；2：TGF-β1；3：TGF-β1+SIS3；4：TGF-β1+SSPH Ⅰ 0.73 μmol·L-1；5：TGF-β1+SSPH Ⅰ 1.46 μmol·L-1；6：TGF-β1+SSPH Ⅰ 2.92 μmol·L-1.(△P<0.05,△△P<0.01vscontrol,**P<0.01vsTGF-β1)

EMT是癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要因素，是很多腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的開始[10-12]，能促進(jìn)癌細(xì)胞侵入其他器官，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT，使細(xì)胞喪失連接和極性，導(dǎo)致侵入性遷移間充質(zhì)細(xì)胞的形成，同時(shí)伴隨著細(xì)胞粘附的破壞，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵入至其他正常組織。EMT的主要表現(xiàn)是E-cadherin表達(dá)降低，同時(shí)N-cadherin和 Vimentin表達(dá)增加。根據(jù)Western blot結(jié)果，與Control組相比，TGF-β1組細(xì)胞的E-cadherin、N-cadherin和 Vimentin蛋白表達(dá)符合上述情況，說明TGF-β1能促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生EMT效應(yīng)，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。隨著SSPH Ⅰ給藥濃度的增加，上述蛋白效應(yīng)被逆轉(zhuǎn)。

TGF-β1/Smad信號(hào)通路是經(jīng)典的信號(hào)傳導(dǎo)通路[13-14]。其中TGF-β1是誘導(dǎo)EMT的重要生物因子。TGF-β1誘導(dǎo)激活TGF-β1/Smad信號(hào)通路，促進(jìn)TGF-β配體結(jié)合II型受體二聚體，引起胞內(nèi) Smad2 和Smad3 的磷酸化，與Smad4形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)相應(yīng)靶基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，例如，上調(diào)N-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)，下調(diào)E-cadherin蛋白的表達(dá)，而這一結(jié)果最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，使癌細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng)[15]。但是，TGF-β1/Smad信號(hào)通路是否在SSPH Ⅰ抑制SMMC-7721侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，值得我們進(jìn)一步驗(yàn)證。通過Western blot實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，TGF-β1能誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生EMT，同時(shí)激活TGF-β1/Smad信號(hào)通路，使得p-Smads2/3蛋白表達(dá)上調(diào)，同時(shí)負(fù)調(diào)控Smads7蛋白表達(dá)。但是SSPH Ⅰ給藥處理細(xì)胞后，上述分子效應(yīng)被阻斷，肝癌細(xì)胞遷移率和侵襲數(shù)量降低。效應(yīng)與TGF-β1/Smad信號(hào)通路抑制劑SIS3相同。除此之外，EMT標(biāo)志性蛋白E-cadherin增加，N-cadherin和Vimentin蛋白降低。表明SSPH Ⅰ通過抑制TGF-β1/Smad阻斷癌細(xì)胞EMT效應(yīng)，從而達(dá)到抑制癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的效果。

綜上所述，SSPH Ⅰ具有拮抗肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用，其機(jī)制與介導(dǎo)TGF-β1/Smad信號(hào)通路，阻斷EMT有關(guān)。SSPH Ⅰ作為一種新型的抗腫瘤中藥，在抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移方面具有積極的意義，這也為SSPH Ⅰ通過靶向EMT治療肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移提供一定的理論實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。