二烯丙基二硫下調(diào)TGF-β1/Rac1通路抑制人胃癌細胞β-catenin表達

蘇 波，丁 恩，曾 穎，夏 紅，劉 芳，蘇 琦

(1.南華大學藥學與藥理學研究所，湖南省高校藥物蛋白質(zhì)組學重點實驗室，湖南 衡陽 421001；2.南華大學腫瘤研究所, 湖南省胃癌研究中心，湖南省高校腫瘤細胞與分子病理學重點實驗室，湖南 衡陽 421001；3. 湖南省中醫(yī)藥專科學校附屬醫(yī)院腫瘤科，湖南 株洲 412012)

轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)誘導腫瘤細胞由上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。信號通路之間相互作用可促進TGF-β1誘導EMT。Rac1通路介導TGF-β1誘導前列腺癌細胞EMT[1]。Rac1促進Wnt3a激活ST2細胞β-catenin[2]。

二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)通過干預多條信號通路抑制腫瘤細胞增殖與侵襲。我們之前報道，DADS下調(diào)Rac1通路可抑制胃癌細胞EMT[3]；DADS下調(diào)β-catenin表達與其抑制胃癌細胞EMT有關(guān)[4]；DADS通過上調(diào)miR22下調(diào)Wnt-1表達，抑制胃癌細胞侵襲與遷移[5]。

本實驗觀察DADS對TGF-β1誘導Rac1和β-catenin表達的影響，探討DADS抑制胃癌細胞EMT是否通過TGF-β1/Rac1通路下調(diào)β-catenin表達。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)人胃癌MGC803細胞株由南華大學腫瘤研究所保存，用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃，5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱。

1.2 試劑DADS 購自Fluka公司，將其與Tween-80按1 ∶2比例溶解，再用生理鹽水稀釋100倍，儲存于-20 ℃冰箱備用。人重組TGF-β1(R&D Systems，USA)；小牛血清(杭州四季青生物工程公司)，RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco公司)；Total RNA Kit(Omega公司)，RT試劑盒(Invitrogen公司)，PCR試劑(Promega公司)；BCA蛋白定量試劑盒(Promega公司)；TGF-β1、Rac1、β-catenin抗體購自Abcam公司，E-cadherin和vimentin購自Cell Signaling Technology公司，β-actin抗體、二抗、ECL發(fā)光試劑盒購自Santa Cruz公司；TGF-β1受體阻斷劑SB431542和Rac1抑制劑NSC23766購自Cayman Chemical公司。

1.3RT-PCR使用Total RNA Kit提取細胞總RNA后，用RT試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。設計擴增引物，使用試劑盒進行PCR。TGF-β1： F 5′-TCT CCA GGC ATT TCC ACT ATT C-3′，R 5′-CTC AGG CAT TCG TCA ACA TCT A-3′；Rac1：F 5′-TGC CTG CTG TTG TAA ATG TCT C-3′，R 5′-AAA GTT CAG TGC TCG GTG TTC T-3′；β-catenin：F 5′-GGA AGG GAC AGT ATC GTT TGT T-3′，R 5′-GCC TCA GCA TCT ACC AGC ATA G-3′；E-cadherin：F 5′-CTC CCA ATA CAT CTC CCT TCA C-3′，R 5′-CGC CTC CTT CTT CAT CAT AGT AA-3′；vimentin：F 5′-GCG AGG AGA GCA GGA TTT CT-3′，R 5′-TCT TGT AGG AGT GTC GGT TGT T-3′; β-actin: F 5′-CTG GGA CGA CAT GGA GAA AA-3′，R 5′-AAG GAA GGA TGG AAG AGT GC-3′。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，用BIO-RAD成像系統(tǒng)拍照，AlphaImager 2200軟件掃描，以β-actin為內(nèi)對照，計算相對光密度值。

1.4Westernblot將收集的細胞置于細胞裂解液中，冰上放置30 min后，12 000 r·min-1離心10 min，提取上清液，BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣本經(jīng)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，膜封閉1 h后孵育一抗，4 ℃過夜。用TBST洗膜，二抗孵育1 h，洗膜后用ECL發(fā)光，X片顯影、定影。

2 結(jié)果

2.1 DADS下調(diào)TGF-β1表達用30 mg·L-1DADS處理胃癌MGC803細胞0、12、24、48 h，分別檢測TGF-β1 mRNA和蛋白水平。如Fig 1A所示，與0 h組比較，TGF-β1 mRNA水平呈時間依賴性下降(P<0.05)；同時，TGF-β1 蛋白水平降低(P<0.05)，其下降趨勢與mRNA一致(Fig 1B)。以上結(jié)果表明，DADS下調(diào)TGF-β1基因表達。

Fig 1 Effect of DADS on expressionof TGF-β1 in MGC803

*P<0.05vs0 h

2.2 DADS通過下調(diào)TGF-β1抑制Rac1表達為了研究DADS下調(diào)TGF-β1是否抑制Rac1表達，我們首先觀察TGF-β1對Rac1表達的影響。如Fig 2所示，用TGF-β1(5 μg·L-1)處理胃癌MGC803細胞24 h后，Rac1 mRNA和蛋白水平上調(diào)(P<0.05)。

用TGF-β1(5 μg·L-1)+SB431542 (10 μmol·L-1)處理細胞，觀察阻斷TGF-β1受體對Rac1表達的影響。與TGF-β1處理組比較，TGF-β1+SB431542組和TGF-β1+DADS組Rac1 mRNA和蛋白表達下調(diào)(P<0.05)(Fig 2)，表明TGF-β1受體阻斷劑可抑制TGF-β1誘導Rac1表達，DADS可通過下調(diào)TGF-β1抑制Rac1表達。同時，TGF-β1(5 μg·L-1)+NSC23766(50 μmol·L-1)處理組Rac1的表達下調(diào)(Fig 2)，提示Rac1阻斷劑NSC23766對Rac1表達也具有抑制作用。

Fig 2 Down-regulation of TGF-β1 byDADS on expression of Rac1 in MGC803

1: control; 2: DADS; 3: TGF-β1; 4: TGF-β1+SB431542;5: TGF-β1+DADS; 6: TGF-β1+NSC23766;*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsTGF-β1

2.3 DADS通過下調(diào)TGF-β1/Rac1抑制β-catenin表達如Fig 3所示，用TGF-β1(5 μg·L-1)處理胃癌MGC803細胞24 h后，β-catenin mRNA和蛋白水平上調(diào)(P<0.05)。與TGF-β1處理組比較，TGF-β1+SB431542組Rac1和β-catenin表達下調(diào)(P<0.05)(Fig 3)。

Fig 3 Down-regulation of TGF-β1/Rac1 by DADSon expression of β-catenin in MGC803

1: control; 2: DADS; 3: TGF-β1; 4: TGF-β1+SB431542;5: TGF-β1+DADS; 6: TGF-β1+NSC23766;*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsTGF-β1

為了確定TGF-β1是否通過Rac1上調(diào)β-catenin表達，用TGF-β1(5 μg·L-1)+NSC23766(50 μmol·L-1)處理細胞，觀察阻斷Rac1對TGF-β1誘導β-catenin表達的影響。與TGF-β1處理組比較，TGF-β1+NSC23766組β-catenin表達下調(diào)(P<0.05)(Fig 3)，表明Rac1可介導TGF-β1上調(diào)β-catenin。

與TGF-β1處理組比較，TGF-β1+DADS組Rac1和β-catenin表達下調(diào)(P<0.05)(Fig 3)，以上結(jié)果表明，DADS通過下調(diào)TGF-β1/Rac1抑制β-catenin表達。

2.4 阻斷TGF-β1/Rac1通路上調(diào)E-cadherin表達如Fig 4所示，與對照組比較，用TGF-β1(5 μg·L-1)處理胃癌MGC803細胞24 h后，E-cadherin mRNA和蛋白水平下降(P<0.05)；用DADS(30 mg·L-1)處理細胞24 h后，E-cadherin mRNA和蛋白表達水平增加(P<0.05)。

與TGF-β1處理組比較，TGF-β1+DADS組E-cadherin mRNA和蛋白表達水平增加(P<0.05)(Fig 4)。SB431542和NSC23766可抑制TGF-β1下調(diào)E-cadherin mRNA和蛋白表達(P<0.05)(Fig 4)。上述結(jié)果表明，DADS抑制TGF-β1/Rac1通路可上調(diào)E-cadherin 表達。

2.5 阻斷TGF-β1/Rac1通路下調(diào)vimentin表達如Fig 5所示，與對照組比較，用TGF-β1(5 μg·L-1)處理胃癌MGC803細胞24 h后，vimentin mRNA和蛋白水平增加(P<0.05)；而DADS(30 mg·L-1)處理細胞24 h后，vimentin mRNA和蛋白水平較對照組明顯降低(P<0.05)。

與TGF-β1處理組比較，TGF-β1+SB431542組和TGF-β1+NSC23766組vimentin mRNA和蛋白水平下降，DADS的作用與SB431542和NSC23766類似(P<0.05)(Fig 5)。結(jié)果表明，DADS可通過抑制TGF-β1/Rac1通路下調(diào)vimentin 表達。

3 討論

TGF-β1通過其受體激活下游信號通路誘導EMT，從而促進腫瘤細胞侵襲和遷移。TGF-β1上調(diào)vimentin、下調(diào)E-cadherin，誘導胃癌細胞EMT[6]。本研究證實，DADS下調(diào)TGF-β1表達，且可抑制TGF-β1對vimentin和E-cadherin表達的影響，提示DADS可能通過影響TGF-β1下游信號通路抑制胃癌細胞EMT。

我們之前報道，DADS下調(diào)Rac1通路和β-cate-nin可抑制胃癌細胞EMT[3，4]。TGF-β1可誘導肝臟星形細胞Rac1表達[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1上調(diào)胃癌細胞Rac1和β-catenin表達，提示TGF-β1不僅通過其受體激活Rac1和β-catenin信號通路，還可能通過上調(diào)Rac1和β-catenin基因表達增強信號通路傳導。TGF-β1受體阻斷劑SB431542可逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導食管癌細胞EMT[8]。我們的研究結(jié)果顯示，DADS和SB431542抑制TGF-β1上調(diào)Rac1和β-catenin表達，表明DADS抑制TGF-β1誘導胃癌細胞Rac1和β-catenin表達。此外，我們發(fā)現(xiàn)Rac1抑制劑NSC23766抑制TGF-β1誘導Rac1表達。文獻報道，NSC23766減少肺上皮細胞釋放TGF-β1、抑制EMT，表明Rac1調(diào)節(jié)TGF-β1表達[9]。我們分析，Rac1與TGF-β1之間可能存在正反饋的調(diào)節(jié)機制，NSC23766可能抑制內(nèi)源性TGF-β1表達，從而削弱外源性TGF-β1誘導的Rac1表達。

Fig 4 Down-regulation of TGF-β1/Rac1 by DADSon expression of E-cadherin in MGC803

1: control; 2: DADS; 3: TGF-β1; 4: TGF-β1+SB431542;5: TGF-β1+DADS; 6: TGF-β1+NSC23766;*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsTGF-β1

Fig 5 Down-regulation of TGF-β1/Rac1 by DADSon expression of vimentin in MGC803

1: control; 2: DADS; 3: TGF-β1; 4: TGF-β1+SB431542;5: TGF-β1+DADS; 6: TGF-β1+NSC23766;*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsTGF-β1

Rac1與Wnt/β-catenin通路之間存在相互作用。在結(jié)腸癌細胞，Rac1募集β-catenin進入核內(nèi)，增強T細胞因子和淋巴增強因子1介導的基因轉(zhuǎn)錄[10]。在乳腺癌細胞，Rac1抑制劑可下調(diào)Wnt/β-catenin通路的活性，抑制細胞遷移與侵襲[11]。我們分析，TGF-β1上調(diào)胃癌細胞Rac1有助于β-catenin的激活，而DADS抑制TGF-β1誘導Rac1表達可能導致β-catenin活性下調(diào)，與其上調(diào)vimentin、下調(diào)E-cadherin、抑制EMT有關(guān)。

Rac1介導β-catenin激活可上調(diào)滋養(yǎng)層細胞Snail和MMP9表達，而下調(diào)Rac1表達可使β-catenin表達和活性下降，提示Rac1不僅調(diào)節(jié)β-catenin的活性，也能上調(diào)β-catenin表達[12]。ERK介導TGF-β1上調(diào)β-catenin表達、誘導腎小管上皮細胞EMT[13]。TGF-β1通過Rac1激活ERK、誘導角質(zhì)細胞EMT[14]。我們之前報道，DADS下調(diào)Rac1[3]和ERK通路[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，NSC23766抑制TGF-β1上調(diào)胃癌細胞β-catenin表達。我們分析，Rac1/ERK通路可能介導TGF-β1上調(diào)β-catenin，DADS可通過抑制TGF-β1/Rac1通路下調(diào)β-catenin表達。

綜上所述，DADS抑制TGF-β1上調(diào)vimentin、下調(diào)E-cadherin，同時DADS下調(diào)Rac1和β-catenin 表達。TGF-β1受體阻斷劑和Rac1抑制劑可抑制TGF-β1誘導β-catenin 表達。上述研究表明，TGF-β1通過Rac1通路上調(diào)β-catenin 表達； DADS抑制胃癌細胞EMT可能與下調(diào)TGF-β1/Rac1通路和β-catenin 表達有關(guān)。