丙戊酸通過GSK3β/β-catenin信號軸抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移

孫 潔，樸俊杰,2，秦云植，任香善,2，王馨悅，林貞花,2

(1. 延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，2. 吉林省科技廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3. 延邊大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，吉林 延吉 133002)

胃癌是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的第三大常見病因[1]。近幾年，隨著分子靶向治療和免疫治療的發(fā)展，我國胃癌患者的5年生存率雖有所提高(約為36%)，但與日、韓等其他胃癌高發(fā)國相比仍存在較大差距(日、韓胃癌患者的5年生存率均超過60%)[2]。轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是影響胃癌患者病死率的主要原因。因此，有效抑制轉(zhuǎn)移將有助于改善胃癌患者的預(yù)后。丙戊酸(valproic acid，VPA)是一種臨床上廣泛應(yīng)用的抗癲癇藥，也是一種組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)抑制劑。研究顯示，VPA參與多種腫瘤(如惡性膠質(zhì)瘤[3]、非小細(xì)胞肺癌[4]、前列腺癌[5]等)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、凋亡的發(fā)生[5]，同時，對于血管形成和轉(zhuǎn)移也具有一定的抑制作用。在腫瘤治療方面，目前的熱點(diǎn)主要是將VPA與化療藥物聯(lián)用來提高化療的抗腫瘤效果[6]。但是，將VPA與何種化療藥物聯(lián)用能夠更加有效地抑制腫瘤的演進(jìn)則缺乏相關(guān)研究。因此，本研究旨在探究VPA對胃癌細(xì)胞增殖、遷移能力的影響及可能涉及的分子機(jī)制，從而為VPA的聯(lián)合用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 人胃癌細(xì)胞株AGS、SGC-7901、MGC-803和BGC-823均由延邊大學(xué)腫瘤研究中心提供。

1.1.2試劑 胎牛血清(10100147)、RPMI1640(C11875500BT)、青霉素/鏈霉素(15140-122)均購自美國Gibco公司。二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(D8371)、四甲基偶氮唑鹽[3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide，MTT ](M8180)均購自北京索萊寶生物科技有限公司。低熔點(diǎn)瓊脂糖(M0815)購自美國Amresco公司。BCA蛋白定量試劑盒(CW0014)購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。VPA(PHR1061)購自美國Sigma Aldrich公司。兔抗上皮鈣黏素(E-cadherin)(3195)、兔抗鋅指轉(zhuǎn)錄因子(Snail)(3879)、兔抗β聯(lián)蛋白(β-catenin)(8480)、兔抗磷酸化糖原合成酶激酶3(p-GSK3βser9)(5558)等抗體均購自美國Cell Signaling Techology公司。小鼠抗波形蛋白(Vimentin)(ab8978)抗體購自美國Abcam公司。小鼠抗β肌動蛋白(β-actin)(TA-09)抗體、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗(ZB-2301)和HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(ZB-2305)均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。山羊抗兔熒光二抗Alexa Fluor? 488(A-11034)、山羊抗小鼠熒光二抗Alexa Fluor? 568(A-11004)均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.3儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo 公司)；全波長多功能酶標(biāo)儀( 瑞士Tecan 公司) ；光學(xué)倒置顯微鏡(日本Olympus 公司)；ChemiDoc 成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad 公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus 公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將AGS、SGC-7901、MGC-803和BGC-823細(xì)胞置于含100 mL·L-1胎牛血清、100 IU·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2MTT實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞消化、離心并以每孔5×103個/100 μL的細(xì)胞數(shù)接種于96孔板。培養(yǎng)8 h后，加入終濃度為0、2、4、6和8 mmol·L-1的VPA，每個藥物濃度設(shè)置5個平行復(fù)孔。分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，每孔內(nèi)加5 g·L-1的MTT溶液20 μL。隨后，培養(yǎng)4 h棄去上清液，每孔內(nèi)加100 μL 的DMSO, 震蕩10 min之后，使用全波長酶標(biāo)儀于570 nm波長測定各培養(yǎng)孔的吸光值(A)。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞生存率：細(xì)胞生存率/%=(用藥組吸光值/對照組吸光值)×100%。

1.2.3軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn) 于6孔板中制備雙層瓊脂糖凝膠(含100 mL·L-1胎牛血清)：下層濃度為12 g·L-1，待凝固后，將5×103個細(xì)胞與濃度為7 g·L-1的瓊脂糖凝膠混合均勻并注于下層膠上。在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周后，觀察細(xì)胞克隆數(shù)并拍照、計(jì)數(shù)。

1.2.4劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞等量接種于6孔板中，待融合度達(dá)到90%時，用200 μL的槍頭在單層細(xì)胞上劃痕。用PBS清洗漂浮的細(xì)胞。分別加入終濃度為0和3.5 mmol·L-1的VPA/RPMI1640培養(yǎng)基。分別于培養(yǎng)0、24和48 h后觀察、拍照。

1.2.5Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞以5×104個/100 μL 的濃度接種于Transwell上室。貼壁后，上室分別加入終濃度為0 mmol·L-1和3.5 mmol·L-1的VPA/RPMI1640無血清培養(yǎng)基，下室加入800 μL RPMI-1640完全培養(yǎng)基， 37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，終止培養(yǎng)。依次進(jìn)行多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色、脫色、取膜、封片后于顯微鏡下觀察、拍照計(jì)數(shù)。

1.2.6免疫印跡實(shí)驗(yàn) 用藥處理結(jié)束后，經(jīng)PBS洗滌、收集細(xì)胞，加入裂解液提取總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測定各組蛋白的濃度。各組蛋白取40 μg樣本進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、5 g·L-1脫脂牛奶封閉1 h后，以1 ∶1 000的比例稀釋兔抗E-cadherin抗體、小鼠抗Vimentin抗體、兔抗Snail抗體、兔抗β-catenin抗體、兔抗p-GSK3βser9抗體和小鼠抗β-actin抗體。一抗4 ℃孵育過夜。次日，用TBS-T洗膜，以1 ∶3 000的比例稀釋山羊抗兔二抗或山羊抗小鼠二抗，室溫孵育2 h后，用ECL法顯影、曝光，以β-actin為內(nèi)參。

1.2.7免疫熒光染色 于6孔板中分組爬片用藥，培養(yǎng)48 h后，依次進(jìn)行PBS洗滌、多聚甲醛固定、Triton-100透化、胎牛血清封閉后，以1 ∶500的比例稀釋兔抗E-cadherin抗體和小鼠抗Vimentin抗體。一抗4 ℃孵育過夜。次日，PBS洗滌后，以1 ∶400的比例稀釋山羊抗兔熒光二抗或山羊抗小鼠熒光二抗，室溫避光孵育2 h。PBS洗滌后，滴入含DAPI的封片劑封片，于熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.8生物信息學(xué)分析 通過STITCH在線數(shù)據(jù)庫篩選VPA的靶向基因；利用STRING在線數(shù)據(jù)庫對VPA的靶向基因進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析；應(yīng)用Enrichr數(shù)據(jù)庫對VPA的靶向基因進(jìn)行分子功能分析(GO)和相關(guān)通路分析(KEGG)。

2 結(jié)果

2.1 VPA抑制AGS、SGC-7901、MGC-803和BGC-823細(xì)胞的增殖活性并呈劑量和時間依賴性分別以0、2、4、6和8 mmol·L-1的VPA處理AGS、SGC-7901、MGC-803和BGC-823細(xì)胞24 h、48 h和72 h后，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VPA可抑制這4種胃癌細(xì)胞的增殖活性，且隨著用藥濃度的升高、用藥時間的延長，細(xì)胞活性逐漸降低，呈劑量和時間依賴性(P<0.05,P<0.01，F(xiàn)ig 1)。根據(jù)MTT的結(jié)果，選取AGS和SGC-7901細(xì)胞，3.5 mmol·L-1用藥濃度和48 h用藥時間進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(VPA處理48 h時，AGS細(xì)胞的IC50為3.25 mmol·L-1，SGC-7901細(xì)胞的IC50為3.65 mmol·L-1)。根據(jù)這一結(jié)果，將3.5 mmol·L-1作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的用藥濃度。

2.2 VPA抑制AGS和SGC-7901細(xì)胞的錨定非依賴性增殖能力軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示：與對照組相比，VPA用藥組的克隆形成數(shù)量明顯減少，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，F(xiàn)ig 2)，提示VPA可抑制AGS和SGC-7901細(xì)胞的錨定非依賴性增殖能力。

2.3 VPA抑制AGS和SGC-7901細(xì)胞的遷移能力劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均顯示，與對照組相比，VPA用藥組細(xì)胞的橫向遷移能力和縱向遷移能力均受到了明顯抑制(P<0.01，F(xiàn)ig 3)，提示VPA可有效抑制AGS和SGC-7901細(xì)胞的遷移能力。

2.4 VPA抑制AGS和SGC-7901細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)進(jìn)程Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，VPA用藥組其上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)上調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin、Snail表達(dá)下調(diào)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，與對照組相比，VPA用藥組的E-cadherin表達(dá)水平明顯上調(diào)， Vimentin的表達(dá)水平明顯下調(diào)(Fig 4)。

Fig 1 Effect of VPA treatment on proliferation of AGS, SGC-7901, MGC-803 and BGC-823 cells in

Cell viability of AGS, SGC-7901, MGC-803 and BGC-823 cells treated by VPA for 0、 2、 4、 6 and 8 mmol·L-1was measured by MTT assay.*P<0.05，**P<0.01vscontrol group.

Fig 2 Effect of VPA treatment on anchorage-independent growth of AGS and SGC-7901 cells in

A:Soft agar colony formation assay(×40); B:Quantification of results.**P<0.01vscontrol group.

Fig 3 Effect of treatment with VPA on migration of AGS and SGC-7901 cells determined by

A:Scratch wound-healing assay(×40); B:Quantification of results; C:Transwell assay(×200); D:Quantification of results.**P<0.01vscontrol group.

2.5 VPA抑制GSK3β/β-catenin信號軸的激活通過STITCH數(shù)據(jù)庫篩選出與VPA存在靶向關(guān)系的蛋白(Fig 5)，其中包括影響腫瘤細(xì)胞分化、增殖及轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵蛋白——GSK3β。通過STRING和Enrichr數(shù)據(jù)庫對GSK3β進(jìn)行了GO分析和KEGG通路分析，結(jié)果顯示GSK3β在胃癌中主要與Wnt信號通路存在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)系，同時與Wnt信號通路的關(guān)鍵蛋白β-catenin存在結(jié)合關(guān)系。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，VPA用藥組其p-GSK3βser9和β-catenin均明顯下調(diào)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示VPA抑制GSK3β/β-catenin信號軸的激活。

3 討論

人體內(nèi)組蛋白的乙酰化和去乙酰化平衡動態(tài)調(diào)節(jié)著基因的穩(wěn)定性[7]。目前的研究顯示，組蛋白乙酰化的失衡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8]。當(dāng)組蛋白呈過度去乙酰化態(tài)時，可下調(diào)抑癌基因的表達(dá)、激活/上調(diào)原癌基因的過表達(dá)，從而推進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因此，增強(qiáng)組蛋白乙酰化酶(histone acetylene transferase，HAT)的作用和(或)降低HDACs的作用一直是表觀遺傳學(xué)抗腫瘤研究的重要方向之一。本研究中使用的VPA為Ⅰ類和Ⅱ類HDAC(HDAC6和HDAC10除外)的抑制劑[9]，可使誘導(dǎo)組蛋白H3 和H4的氨基末端發(fā)生超乙酰化，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[10-11]。

在本研究中，我們通過MTT法檢測了VPA對胃癌細(xì)胞AGS、SGC-7901、MGC-803和BGC-823增殖活性的影響。結(jié)果顯示，VPA可以顯著抑制這4種細(xì)胞的增殖活性，且呈劑量和時間依賴性，表明VPA對于胃癌細(xì)胞的藥物作用具有較強(qiáng)的廣譜性。選用對VPA較為敏感的AGS和SGC-7901細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象后，進(jìn)一步的軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，VPA可以抑制AGS和SGC-7901細(xì)胞的錨定非依賴性增殖能力，提示VPA可以從細(xì)胞活性和細(xì)胞數(shù)量這兩個方面抑制胃癌細(xì)胞的增殖能力。這一結(jié)果與Zhang等[12]的研究結(jié)果相一致。

Fig 4 EMT progression of AGS and SGC-7901 cells suppressed

A:Expression of E-cadherin, Vimentin and Snail was detected in VPA-treated AGS and SGC-7901 cells by Western blot. β-actin was set as loading control; B:Expression of E-cadherin and Vimentin in VPA-treated AGS and SGC-7901 cells was detected by immunofluorescence staining(×400).**P<0.01vscontrol group.

Fig 5 Blockade of GSK3β/β-catenin signal axis by VPA in AGS and SGC-7901

A-C:Network of VPA-GSK3β/β-catenin interactions in STITCH database, STRING database and Enrichr database; B:Expression of p-GSK3βser9and β-catenin was detected in VPA-treated AGS and SGC-7901 cells by Western blot. β-actin was set as loading control.**P<0.01vscontrol group.

大量研究證實(shí)，Wnt/β-catenin信號通路的激活不僅參與腫瘤的形成，也參與EMT進(jìn)程的啟動。GSK3β作為β-catenin上游重要的負(fù)性調(diào)控因子，其失活與β-catenin的表達(dá)呈正相關(guān)。而GSK3β的活性主要受磷酸化位點(diǎn)的調(diào)控。當(dāng)GSK3β的N-端絲氨酸9位點(diǎn)(Ser9)發(fā)生磷酸化時，其活性受到抑制；當(dāng)GSK3β的N-端酪氨酸216位點(diǎn)(Tyr 216)發(fā)生磷酸化，則可增強(qiáng)GSK3β的活性。在本研究中，通過STITCH、STRING和Enrichr數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，VPA與GSK3β/β-catenin信號軸存在顯著相關(guān)性。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，VPA可以抑制GSK3β/β-catenin信號軸的激活，提示GSK3β/β-catenin信號軸參與了VPA對胃癌細(xì)胞增殖和遷移功能的調(diào)控。

綜上，VPA可有效抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移，其機(jī)制可能與抑制GSK3β/β-catenin信號軸的激活及逆轉(zhuǎn)EMT的進(jìn)程有關(guān)。

(致謝:本實(shí)驗(yàn)是在吉林省科技廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、延邊大學(xué)腫瘤研究中心分子病理實(shí)驗(yàn)室完成，感謝實(shí)驗(yàn)室各位老師的指導(dǎo)與幫助。)