柚皮苷改善CCL2所致大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙及其機(jī)制

龍江宜，陳健民，廖苑君，周怡俊，梁冰玉，周 燕

(廣西醫(yī)科大學(xué)1.藥學(xué)院、2. 廣西艾滋病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021)

CC類趨化因子配體2(chemokine CC motif ligand 2，CCL2)，又稱為單核細(xì)胞趨化蛋白-1 (monocyte chemoattractant protein -1，MCP-1) ，是CC類趨化因子家族的重要成員。CCL2作為趨化作用最強(qiáng)的因子之一，對(duì)單核吞噬細(xì)胞、活化的T細(xì)胞和B細(xì)胞具有強(qiáng)大的激活和募集作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)，CCL2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)中扮演著重要的角色。生理?xiàng)l件下，CCL2能維持神經(jīng)元的正常活性，并參與神經(jīng)元通訊交流等生理功能[1]。然而，過(guò)表達(dá)的CCL2參與了多種CNS疾病發(fā)生的病理生理過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，在阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease，AD)、血管性癡呆(vascular dementia，VD)和艾滋性認(rèn)知功能障礙(HIV-associatedneurocognitive disorder，HAND)等患者的腦脊液中均檢測(cè)到CCL2的高水平表達(dá)，而這些患者均伴隨有不同程度的認(rèn)知功能障礙[1, 2]，表明CCL2與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生密切相關(guān)。

氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、興奮性毒性以及細(xì)胞凋亡是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要發(fā)病機(jī)制，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)CCL2通過(guò)過(guò)度激活N-甲基-D-天冬酰胺受體(N-methyl-D-aspartate receptors, NMDAR)能損傷大鼠的學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能，其機(jī)制與上述四條途徑均有聯(lián)系。因此，我們認(rèn)為CCL2作為誘導(dǎo)認(rèn)知功能障礙等神經(jīng)退行性疾病的重要致病因子，針對(duì)CCL2觸發(fā)認(rèn)知障礙的機(jī)制有抑制或者阻斷作用的藥物將在治療認(rèn)知功能障礙或者提高學(xué)習(xí)記憶力方面展現(xiàn)出良好的臨床運(yùn)用前景，但目前在神經(jīng)藥理領(lǐng)域關(guān)于對(duì)抗CCL2效應(yīng)及作用的藥物研究還十分有限。

柚皮苷(naringin)是一種存在于葡萄柚和其他柑橘類水果中的黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)糖脂代謝和保護(hù)心肌等多種生物學(xué)保護(hù)作用，能通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)對(duì)心血管疾病、糖尿病的治療及神經(jīng)變性的預(yù)防起到良好作用[3, 4]。有研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷能下調(diào)動(dòng)脈粥樣硬化和炎癥反應(yīng)中CCL2的表達(dá)，起到抗動(dòng)脈粥樣硬化和抗炎作用[5]。此外，柚皮苷能夠增強(qiáng)人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)膜糖蛋白120(glycoprotein 120，gp120)誘導(dǎo)艾滋性認(rèn)知功能障礙的大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，改善其認(rèn)知功能障礙[6]。而關(guān)于柚皮苷是否能對(duì)抗CCL2誘發(fā)的認(rèn)知功能障礙還尚未可知，故本文通過(guò)腦部立體注射將CCL2注射至雙側(cè)海馬腦區(qū)，制作認(rèn)知功能障礙大鼠模型，預(yù)防性3 d給予柚皮苷，利用Morris水迷宮(Morris water maze，MWM)評(píng)價(jià)柚皮苷對(duì)CCL2誘發(fā)的認(rèn)知功能障礙模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，并從形態(tài)學(xué)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡三個(gè)方面評(píng)價(jià)其保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器CCL2(R&D systems，批號(hào)：279-MC/CF)，柚皮苷(Sigma公司；批號(hào)BCBT3477)，美金剛(memantine，批號(hào)：M9292)，caspase-8、caspase-3、Bax、Bcl-2、GAPDH引物(上海捷瑞生物工程有限公司)；AxyPrep總RNA制備試劑盒(康寧生命科學(xué)有限公司，批號(hào)：07418KD1)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，批號(hào)：RR047A)；SYBR熒光染料擴(kuò)增試劑盒(TaKaRa，批號(hào)：RR820A)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutas，SOD)試劑盒(南京建成生物工程所，批號(hào):20181121)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(南京建成生物工程所，批號(hào)：20181029)；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)試劑盒(南京建成生物工程所，批號(hào)：20181116)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天，批號(hào)：P0010S)。腦立體定位儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司，型號(hào)C9S02-003)；手型顱骨鉆(深圳瑞沃德生命科技有限公司，型號(hào)68605)；10 μL Hamilton微量注射器(Hamilton公司，型號(hào)：701N)；Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)裝置及分析系統(tǒng)(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理56只SPF級(jí)♂SD大鼠，體質(zhì)量(180±20)g，購(gòu)自于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK桂2014-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SCXK桂2014-0003。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，允許自由攝食飲水。SD大鼠隨機(jī)分為7組：空白對(duì)照組(control)、假手術(shù)組(sham)、模型組(5 ng CCL2)組、陽(yáng)性藥組(5 ng CCL2+10 mg·kg-1memantine)、柚皮苷低劑量組(5 ng CCL2+25 mg·kg-1柚皮苷)、柚皮苷中劑量組(5 ng CCL2+50 mg·kg-1柚皮苷)和柚皮苷高劑量組(5 ng CCL2+100 mg·kg-1柚皮苷)，每組8只。除空白對(duì)照組外，其余各組均進(jìn)行雙側(cè)海馬內(nèi)注射制作動(dòng)物模型，陽(yáng)性藥美金剛(memantine)及各劑量柚皮苷組于造模前3 d腹腔注射(ip)，d 3藥物注射后的30 min后進(jìn)行腦部立體定位手術(shù)。

1.3 模型制備配制1%的戊巴比妥鈉溶液，按45 mg·kg-1劑量腹腔注射麻醉。待動(dòng)物麻醉后，顱頂區(qū)常規(guī)備皮，碘伏消毒。參照大鼠腦立體定位圖譜，以前囟為原點(diǎn)，按AP=-3.7 mm、ML=±3.0 mm、DV=-3.0 mm的坐標(biāo)位置進(jìn)行海馬區(qū)注射，注射速度為0.3 μL·min-1，每側(cè)注射體積為2.5 μL，注射完成后停針5 min避免藥物外漏，隨后緩慢提針。注射完成后縫合皮膚，并注射青霉素(30萬(wàn)單位·kg-1)防止感染。假手術(shù)組給予等量無(wú)菌生理鹽水。

1.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)Morris水迷宮試驗(yàn)主要通過(guò)Morris水迷宮分析系統(tǒng)完成，包括一個(gè)圓形水池、視頻采集系統(tǒng)、軟件分析系統(tǒng)。水池直徑160 cm,高60 cm，實(shí)驗(yàn)時(shí)在水池內(nèi)注入自來(lái)水，水深42 cm，水溫(22±1) ℃。將水池池壁分為四等份，分別記為E、S、W及N四個(gè)象限，在每個(gè)象限的池壁部分中心放置大小相近，不同形狀的白色標(biāo)記物，用于幫助大鼠空間定位。在象限S的中心處放置一個(gè)位于水下2 cm、直徑為12 cm、高40 cm的水下平臺(tái)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中平臺(tái)位置不變。

大鼠術(shù)后3 d開(kāi)始進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，通過(guò)Morris水迷宮試驗(yàn)評(píng)測(cè)SD大鼠學(xué)習(xí)和空間記憶能力。參照以往方法[7]進(jìn)行。Morris水迷宮試驗(yàn)包括定位航行試驗(yàn)(D4～D8)和空間探索試驗(yàn)(D9)兩部分。在定位航行試驗(yàn)前1 d(D3)即術(shù)后d 3對(duì)大鼠進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練。即將大鼠從任一入水點(diǎn)放入水中，自由游泳1 min。定位航行試驗(yàn)著重檢測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)能力，其評(píng)價(jià)指標(biāo)包括逃避潛伏期、游泳速度及游泳距離；空間探索試驗(yàn)在定位航行試驗(yàn)后24 h進(jìn)行，主要用于評(píng)價(jià)大鼠的空間記憶力，其評(píng)價(jià)指標(biāo)為大鼠穿過(guò)原水下平臺(tái)位置的次數(shù)，即穿越次數(shù)。

1.5 HE染色水迷宮實(shí)驗(yàn)后，每組4只大鼠心臟灌注后取全腦石蠟包埋切片進(jìn)行HE染色，以探究CCL2是否對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元CA1區(qū)造成損傷。HE按照常規(guī)方案進(jìn)行，5～7 μm縱切片，二甲苯脫蠟蘇木素-伊紅染色。后用中性樹(shù)脂密封，使用Olympus BX53顯微鏡拍攝。

1.6 SOD、GSH-Px活力以及MDA含量檢測(cè)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)后將各組大鼠于冰上迅速斷頭取腦，分離海馬組織。取每組4只大鼠的一側(cè)海馬用于氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)。冰上研磨海馬組織制備10%的海馬勻漿，BCA法檢測(cè)各樣本蛋白總濃度，試劑盒檢測(cè)SOD、GSH-PX活力以及MDA含量。

1.7 凋亡基因caspase-8、caspase-3、Bax以及Bcl-2基因表達(dá)檢測(cè)上述大鼠的另一側(cè)海馬用于凋亡相關(guān)基因檢測(cè)。按柱式RNA提取試劑盒的說(shuō)明提取總RNA，微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀檢測(cè)各樣本RNA的濃度及吸光度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按擴(kuò)增試劑盒的說(shuō)明對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，獲得各目的基因的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，記錄各基因的Ct值，以GAPDH為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt法計(jì)算結(jié)果，引物序列見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Primers’ sequence of target genes

2 結(jié)果

2.1 柚皮苷對(duì)大鼠學(xué)習(xí)能力的保護(hù)作用結(jié)果如Tab 2，F(xiàn)ig 2和Fig 3，F(xiàn)ig 4所示，各組大鼠平均游泳速度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明各組大鼠運(yùn)動(dòng)能力一致，并且腦部立體定位手術(shù)對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)能力沒(méi)有明顯影響。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠逃避潛伏期增加(P<0.01)；與模型組大鼠相比，柚皮苷給藥組大鼠逃避潛伏期及游泳總路程均縮短(P<0.01)。Fig 1顯示的是定位航行實(shí)驗(yàn)d 5各組大鼠的游泳軌跡。

Tab 2 Results of swimming speed, escape time and swimming distance of rats in each group

**P<0.01vsmodel；##P<0.01vssham

2.2 柚皮苷對(duì)大鼠空間記憶的保護(hù)作用結(jié)果如Tab 3，F(xiàn)ig 5所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠組穿越平臺(tái)次數(shù)減少(P<0.01)；與模型組相比，柚皮苷給藥組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)增加(P<0.05)。

2.3 柚皮苷對(duì)大鼠的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用結(jié)果如Fig 6所示，與空白組和假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元排列松散，胞體固縮，細(xì)胞核深染，出現(xiàn)大量鬼影細(xì)胞；與模型組相比，各柚皮苷給藥組，尤其是中、高劑量組大鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元排列相對(duì)緊密，核深染和固縮的細(xì)胞數(shù)目較少。

Fig 1 Typical swimming path of rats in navigation test on 5th training day

Fig 2 Swimming speed of rats in each

Tab 3 Results of crossing times of rats in each group

*P<0.05，**P<0.01vsmodel；#P<0.05vssham

Fig 3 Escape latency of rats in each

**P<0.01vsmodel;##P<0.01vssham

Fig 4 Swimming distance of rats in each

**P<0.01vsmodel;##P<0.01vssham

*P<0.05,**P<0.01vsmodel;#P<0.05vssham

2.4 柚皮苷對(duì)大鼠海馬組織SOD、MDA、GSH-PX的影響結(jié)果如Tab 4，F(xiàn)ig 7所示，與假手術(shù)相比，模型組大鼠海馬組織SOD、GSH-PX活力均降低，MDA含量增加(P<0.05)；與模型組相比，柚皮苷給藥組海馬組織SOD、GSH-PX活力均升高，MDA含量降低(P<0.05)。

Fig 6 Neuronal structure of hippocampal CA1 area in rats among groups(×20)

2.5 柚皮苷對(duì)大鼠海馬組織caspase-3、caspase-8、Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響結(jié)果如Table 5，F(xiàn)ig 8所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬組織caspase-3、caspase-8、Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量增加(P<0.05)，Bcl-2mRNA表達(dá)量降低(P<0.05)；與模型組相比，柚皮苷給藥組大鼠海馬組織caspase-3、caspase-8、Bax mRNA的相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)，Bcl-2相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)。

3 討論

趨化因子CCL2，也稱為MCP-1，屬于CC類趨化因子家族，是趨化活性最強(qiáng)的趨化因子之一[8]。

*P<0.05,**P<0.01vsmodel;#P<0.05，##P<0.01vssham

Tab 4 Results of SOD activity, MDA content, GSH-PX activity in hippocampus of rats in each group

*P<0.05，**P<0.01vsmodel；#P<0.05，##P<0.01vssham

Tab 5 Relative expression of caspase-8, caspase-3, Bcl-2 and Bax mRNA in rat hippocampus

*P<0.05，**P<0.01vsmodel；#P<0.05，##P<0.01vssham

Fig 8 Relative expression of caspase-3, caspase-8, Bax and Bcl-2mRNA in rat hippocampus

*P<0.05,**P<0.01vsmodel;#P<0.05，##P<0.01vssham

研究發(fā)現(xiàn)，異常高表達(dá)的CCL2參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病如缺血性腦卒中，創(chuàng)傷性腦外傷以及神經(jīng)退行性疾病的病理生理過(guò)程。大腦中激活狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞能釋放CCL2，通過(guò)促炎性反應(yīng)上調(diào)炎癥介質(zhì)IL-1β、TNF-α的表達(dá)，從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，損傷神經(jīng)元[8]。除參與炎癥反應(yīng)外，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CCL2能通過(guò)誘導(dǎo)海馬區(qū)氧化應(yīng)激和興奮性毒性，并最終促進(jìn)海馬區(qū)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能的減退，這一現(xiàn)象與臨床數(shù)據(jù)相吻合。研究人員從AD、VD以及HAND等疾病[4]患者的腦脊液中檢測(cè)到高水平表達(dá)的CCL2，且其表達(dá)水平與患者出現(xiàn)的認(rèn)知障礙程度呈現(xiàn)正相關(guān)性[1, 2, 9]，表明CCL2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病過(guò)程中扮演了十分重要的角色。

目前針對(duì)CCL2為治療靶點(diǎn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)治療藥物的研究十分有限。因此本課題組擬在前期對(duì)CCL2中樞致病機(jī)制研究的基礎(chǔ)上以期尋找一些能對(duì)抗CCL2的潛在治療藥物。柚皮苷(naringin)是一種天然存在于葡萄柚和其他柑橘類水果中的黃酮類化合物，被證明具有抗炎、抗氧化、調(diào)查糖脂代謝和保護(hù)心肌等多種生物學(xué)功效[4, 6, 10]。此外，研究發(fā)現(xiàn)柚皮苷能下調(diào)動(dòng)脈粥樣硬化中炎癥因子CCL2的表達(dá)[5]，起到血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)研究柚皮苷是否能在神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)CCL2誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶損傷有保護(hù)作用。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是行為神經(jīng)科學(xué)研究中最長(zhǎng)用的研究工具之一，常用于驗(yàn)證嚙齒類動(dòng)物神經(jīng)認(rèn)知疾病模型，評(píng)估神經(jīng)認(rèn)知功能治療的可行性。我們的前期研究已經(jīng)證實(shí)：CCL2雙側(cè)海馬注射能成功制作認(rèn)知功能障礙大鼠模型，通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)可以確定模型組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力受到顯著損傷[7]，本研究進(jìn)一步在此認(rèn)知功能障礙大鼠模型上，探究柚皮苷能否改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶力。經(jīng)典的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)由定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩部分組成，前者著重檢測(cè)嚙齒動(dòng)物的學(xué)習(xí)能力，后者主要用于檢測(cè)動(dòng)物記憶的維持能力。我們的研究結(jié)果表明：(1)在定位航行試驗(yàn)中，各組大鼠游泳速度均無(wú)明顯差異，表明我們的手術(shù)未對(duì)大鼠的運(yùn)動(dòng)能力造成影響。在預(yù)防性給予柚皮苷給藥3 d后，柚皮苷給藥組大鼠逃避潛伏期和游泳路程較模型組均顯著降低，表明柚皮苷能夠?qū)CL2損傷大鼠的學(xué)習(xí)能力起到保護(hù)作用。(2)在空間探索實(shí)驗(yàn)中各柚皮苷給藥組穿越次數(shù)顯著高于模型組，顯示出良好的對(duì)大鼠空間記憶保護(hù)能力。兩部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有高度一致性，表明柚皮苷能很好的保護(hù)由CCL2海馬注射誘發(fā)的大鼠學(xué)習(xí)記憶力損傷。

海馬是與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的腦區(qū)之一，主要參與近期陳述性記憶和情景記憶的形成，其功能的完整性依賴于海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的完整。故在上述行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，我們利用HE染色觀察各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)。HE結(jié)果顯示模型組大鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元條帶淺薄且排列松散，出現(xiàn)神經(jīng)元胞質(zhì)深染，胞體縮小變形；柚皮苷給藥后，各組大鼠，尤其是中高劑量大鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元排列相對(duì)整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對(duì)清晰，表明柚皮苷對(duì)CCL2誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷具有良好保護(hù)作用，與上述行為學(xué)結(jié)果一致。

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知障礙的原因之一，在癡呆發(fā)生的早期扮演重要的作用[11]。正常情況下，機(jī)體內(nèi)的氧化-抗氧化系統(tǒng)維持相對(duì)動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，過(guò)多的反應(yīng)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)會(huì)被自身的抗氧化酶SOD、GSH-PX清除，但當(dāng)氧化程度超過(guò)自身清除能力的時(shí)候，氧化平衡將被打破，導(dǎo)致神經(jīng)組織氧化應(yīng)激損傷最終引起學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能受損。SOD是一種內(nèi)源性抗氧化酶，是機(jī)體清除超氧陰離子等自由基的重要物質(zhì)，超氧陰離子存在機(jī)體多個(gè)組織中，性質(zhì)活波，與羥基結(jié)合后可形成損害細(xì)胞的物質(zhì)，SOD可阻斷并對(duì)抗氧自由基對(duì)組織細(xì)胞的損害。此外，GSH-PX是機(jī)體廣泛存在的另一種重要的催化過(guò)氧化氫分解的酶。它特異性的催化還原性谷胱甘肽(glutathione，GSH)對(duì)過(guò)氧化氫的還原反應(yīng)，清除體內(nèi)自由基、脂質(zhì)過(guò)氧化物并能防止血紅蛋白及其他輔因子受氧化損傷。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化物的主要代謝產(chǎn)物，主要是由于ROS攻擊細(xì)胞膜產(chǎn)生，能間接反映神經(jīng)細(xì)胞的損傷程度。我們前期研究發(fā)現(xiàn)CCL2能降低海馬區(qū)SOD活力并升高M(jìn)DA含量，表明CCL2能誘導(dǎo)海馬發(fā)生氧化應(yīng)激[7]。據(jù)報(bào)道，柚皮苷通過(guò)抗氧化應(yīng)激改善2型糖尿病大鼠認(rèn)知缺陷[4]，說(shuō)明柚皮苷具有一定的抗氧化作用。但是，柚皮苷是否能對(duì)抗中樞神經(jīng)系統(tǒng)CCL2引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)尚未可知。本研究表明，柚皮苷能提高中樞海馬組織SOD和GSH-PX兩種抗氧化酶的活性，并減低脂質(zhì)過(guò)氧化物產(chǎn)物MDA的含量，起到明顯抗氧化作用，說(shuō)明在CCL2誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙模型大鼠上，柚皮苷的神經(jīng)保護(hù)作用與抗氧化效應(yīng)密切相關(guān)。

細(xì)胞凋亡是機(jī)體內(nèi)清除老化、壞死的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞的程序性死亡，有利于保證機(jī)體的正常生理功能。然而，在如氧化應(yīng)激等條件刺激下，凋亡的異常發(fā)生往往參與了神經(jīng)退行性疾病的病理生理過(guò)程[12]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)明顯的細(xì)胞死亡現(xiàn)象，而用柚皮苷干預(yù)后能明顯改善其神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷，顯示出了一定的神經(jīng)保護(hù)作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)CCL2能通過(guò)誘導(dǎo)海馬區(qū)氧化應(yīng)激上調(diào)促凋亡基因caspase-8、caspase-3、Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡[7]。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討柚皮苷的抗凋亡作用。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，柚皮苷能通過(guò)下調(diào)促凋亡基因caspase-8、caspase-3以及Bax的表達(dá)，上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，在CCL2誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙模型大鼠上發(fā)揮良好的抗凋亡效應(yīng)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)柚皮苷能對(duì)抗CCL2引起的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷，改善CCL2誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶損害和認(rèn)知障礙，其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制主要是通過(guò)降低CCL2誘導(dǎo)的海馬氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制caspase-8，caspase-3凋亡通路，并下調(diào)促凋亡基因Bax，上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2而發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)，保護(hù)神經(jīng)元，并最終改善學(xué)習(xí)記憶力。

(致謝：本文中水迷宮實(shí)驗(yàn)在廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院完成，試劑盒、RT-PCR在廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞與免疫實(shí)驗(yàn)室完成。感謝各位老師和同學(xué)給予的幫助。)