β-石竹烯對小鼠腦缺血/再灌注白質損傷的保護作用研究

王 倩，饒江燕，王鈺淳，向菲，徐 露，田曉翠，董志

(1.重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室，2. 重慶醫(yī)科大學藥理學教研室，重慶 400016；3.重慶醫(yī)藥高等專科學校藥學院，重慶 401331)

腦卒中的發(fā)病率和死亡率居世界第二位，在中國每年有超過200萬的新病例，是致殘率最高的疾病[1-2]。缺血性腦卒中的常見原因是頸內或顱內血管阻塞，大腦血液供應不足，導致急性缺糖缺氧，引起嚴重的神經系統(tǒng)功能障礙[3]。中風不僅會導致灰質損傷，還會引起深層的白質損傷，大腦白質主要由深穿支動脈供血,很容易發(fā)生缺血性損傷，常常比灰質受到更嚴重的損傷，這是導致腦卒中發(fā)生率升高和神經功能不良的危險因素[4]。迄今為止，組織型纖溶酶原激活物(tPA)是FDA批準用于缺血性中風的有效的治療劑。 然而，其嚴重的不良反應和有限的治療時間窗，使其僅適用于所有中風患者的4%～7%[5]。β-石竹烯(β-caryophyllene，BCP)，是一種雙環(huán)倍半萜型化合物，研究表明，BCP通過調節(jié)多種途徑，發(fā)揮抗氧化、抗炎、抗凋亡和保護血腦屏障，它對腦缺血具有神經保護作用[6-7]。雖然BCP目前在腦缺血/再灌注(cerebral ischemia-reperfusion，CIR)損傷模型中有較多的研究，但其作用的具體分子機制還不十分清楚，關于CIR白質損傷(white matter injury，WMI)的研究也很少，本實驗采用線栓法建立小鼠CIR損傷模型，給予BCP預處理，觀察BCP對CIR損傷后小鼠白質的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品、試劑β-石竹烯(純度>80%)，(W225207)，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)，(T8877) 購自Sigma公司；mbp(10458-1-AP)、NF(60189-1-lg)、Bcl-2(12789-1-AP)、Bax(50599-2-lg)和caspase-3 (19677-1-AP) 等抗體均購自Proteintech公司。

1.2 實驗儀器電泳儀(北京六一生物科技有限公司)，成像儀(BIO-RAD)，正置熒光顯微鏡(Nikon)，高速低溫離心機(Thermo公司)，電熱鼓風干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1實驗動物與分組 SPF級♂C57BL/6小鼠75只，體質量為(20±2)g，購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心(許可證號: SCXK 渝 2018-0003)，將C57BL/6小鼠隨機分為正常對照組(Control)、模型組(CIR)、BCP治療組(36、72、144 mg·kg-1)，BCP用10%蓖麻油和生理鹽水配制，以0.01 mL·g-1連續(xù)灌胃給藥d 1～5，Control組和CIR組給相同溶劑。

1.3.2建立小鼠腦缺血/再灌注模型 采用線栓法制作小鼠大腦 MCAO模型。通過腹腔注射4%的戊巴比妥鈉將小鼠麻醉，在手術臺上以仰臥位固定，沿頸部正中切開皮膚，找到右頸總動脈(CCA)、頸內動脈(ICA)、頸外動脈(ECA)分支，并結扎ECA、CCA，用動脈夾暫時阻斷ICA血流，在CCA剪一切口，從切口插入直徑為(18.5±0.5) mm線栓至ICA，感到阻力時停止，固定線栓,缺血1 h后，將線栓拔出使血流恢復，縫合傷口，再灌注24 h后，進行后續(xù)實驗。

1.3.3神經行為學評分 再灌注24 h后，使用Longa等5分制評分對小鼠進行神經行為學評分。

1.3.4腦梗死體積測定 再灌注24 h后，將小鼠麻醉取腦，于-20 ℃放置30 min，作2 mm厚度的連續(xù)切片，于2%的TTC染液中，37 ℃水浴避光染色15 min，反面繼續(xù)染色15 min，4%多聚甲醛固定過夜，拍照。運用Image J軟件分析腦小鼠腦梗死體積。

1.3.5腦含水量測定 再灌注24 h后，取出受傷側腦組織稱量其濕重后，放入120 ℃的烘箱內干燥48 h至恒重，即為干重。腦水含量(BWC) =(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3.6Western blot法檢測mbp、NF、Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白的表達 再灌注24 h，小鼠麻醉以取腦，分離受損側白質，蛋白裂解液提取蛋白(RIPA-PMSF-磷酸酶抑制劑=100 ∶1 ∶2)，電泳分離，切膠，轉膜，5%的胎牛血清蛋白(BSA)封閉4 h，然后加入相應的一抗，抗體稀釋比例均為1 ∶1 000～2 000，4 ℃冰箱孵育過夜，TBST洗膜(3×5 min)，再分別二抗孵育40 min，三抗孵育30 min，洗膜后，采用增強化學發(fā)光液(ECL)顯影成像。應用Image Lab軟件進行圖像分析，β-actin作為內參。

1.3.7HE染色 再灌注24 h后，小鼠麻醉后仰臥固定，先用200 mL PBS心臟灌注15 min，然后用4%多聚甲醛(約60 mL)灌注固定至小鼠全身僵硬，斷頭取腦，繼續(xù)在4%多聚甲醛中固定過夜，石蠟包埋，切片(厚5 μm)。按照HE染色試劑盒說明書染色，于200倍視野下觀察胼胝體髓鞘的病理改變情況。

1.3.8透射電鏡 再灌注24 h后，麻醉取腦，在胼胝體區(qū)取1 mm3大小組織塊，2.5%的戊二醛4℃固定，于重慶醫(yī)科大學生科院電鏡室進行后面步驟，并采集圖片。

1.3.9LFB染色 再灌注24 h后，按1.3.7項下操作進行灌注、外固定，用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，切片(5 μm)，根據LFB染色試劑盒說明書染色，計算髓鞘染色光密度值(OD)。

2 結果

2.1 BCP降低CIR小鼠腦梗死體積，減輕神經功能缺損和腦含水量與正常對照組相比，缺血1 h，再灌注24 h后，小鼠缺血側腦組織出現大面積梗死，肢體有明顯的偏癱，神經行為學評分升高，腦組織嚴重水腫；與模型組相比，BCP組可減少小鼠腦梗死體積，降低神經行為學評分，減輕腦組織水腫(Fig 1A、B、C、D )。結果表明，BCP能夠減輕小鼠缺血/再灌注后損傷，其中中等劑量(72 mg·kg-1)效果最好，呈現出劑量依賴性保護作用。

Fig 1 Effects of BCP on cerebral infarction volume, neurobehavioral and cerebral edema in CIR mice

2.2 HE染色觀察CIR后腦白質的病理學改變與正常對照相比，模型組小鼠的腦白質出現明顯的病理學改變：肉眼可見明顯的腦水腫，鏡下可見胼胝體白質疏松，纖維排列疏松凌亂，有空泡樣改變。而BCP組CIR小鼠腦白質的病理學改變較輕，神經纖維排列緊密，胼胝體空泡面積明顯較少(Fig 2A,2B)。

Fig 2 Effect of BCP on pathological changes of white matter in CIR mice n=5)

A: HE staining of brain sections (×200); B: The quatitative diagram of the area of vacuoles in the corpus callosum.**P<0.01vs control group;#P<0.05,##P<0.01vsCIR

2.3 透射電鏡顯示對CIR小鼠胼胝體髓鞘的影響如Fig 3所示，正常對照組中，胼胝體的髓鞘結構致密，染色深，呈板狀排列；模型組神經纖維出現脫髓鞘現象，髓鞘著色明顯變淺，厚度變薄，髓鞘板層疏松、剝脫，髓鞘板層斷裂為小碎片或空泡，軸索內細胞器腫脹。給予BCP治療后，能夠明顯減輕上述髓鞘的退行性改變。

Fig 3 Effect of BCP on ultrastructure of corpus callosum myelin sheath in CIR mice(8000×100 kV) Black arrows showed damaged corpus callosum

2.4 LFB染色觀察CIR小鼠腦白質的髓鞘損傷正常對照組中，小鼠胼胝體LFB著色較深，髓鞘排列整齊致密，無水腫、分層。模型組LFB著色較淺，髓鞘排列疏松、有部分崩解，呈空泡狀。經BCP治療之后，髓鞘損傷減輕，LFB染色加深，LFB染色的光密度值較模型組升高(Fig 4A,4B)。

2.5 BCP對CIR小鼠缺血側腦白質中mbp、NF及凋亡相關蛋白表達的影響Western blot 結果顯示：CIR 后，小鼠腦白質中mbp、NF和Bcl-2 蛋白表達明顯減少，BCP治療后，可明顯提高mbp、NF和Bcl-2 蛋白的表達水平。而CIR后，Bax和caspase-3表達增多，BCP組則減少其在白質中的表達，其中72 mg·kg-1劑量組變化最明顯(Fig 5)。

3 討論

灰質(gray matter，GM)和白質(white matter，WM)是中樞神經系統(tǒng)重要的兩個組成部分，大約各占人類大腦的一半[8]，WM由密集的有髓鞘和無髓鞘軸索束組成，這些軸索束來自中樞神經系統(tǒng)的各種投射神經元[9]。研究表明，WMI能夠引發(fā)傳導束變性，引起運動、感覺等神經活動的聯(lián)絡中斷而導致神經功能的障礙[10-11]。胼胝體使大腦的兩個半球能夠快速交流，但它也是皮質下白質卒中或血管性癡呆的主要損傷部位[9]。本實驗著重研究BCP對CIR小鼠胼胝體髓鞘損傷的影響作用。

Fig 4 Effect of BCP on injury of corpus callosum myelin sheath in CIR mice by LFB staining n=3)

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsCIR

白質的主要組成細胞是神經膠質細胞，其中少突膠質細胞(oligodendrocyte，OLG)是形成髓鞘的主要成分，成熟的OLG是合成髓磷脂構成髓鞘的主要成分，它的突起包繞軸突形成髓鞘[12]。髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，mbp)，由成熟的少突膠質細胞分泌，是髓鞘相關性蛋白的主要成分，約占30%，對髓鞘的致密性起作用，集中分布在有髓纖維，是成熟少突膠質細胞功能活動的標記物[13]。在CIR發(fā)生時，OLG受損傷可導致mbp甲基化障礙，引起髓鞘整體結構的穩(wěn)定性下降，髓鞘結構的致密性受到損傷進而導致髓鞘脫失，使神經軸突的營養(yǎng)及保護減弱甚至消失，進一步引發(fā)了軸索變性[14]。本研究選擇mbp作為髓鞘損傷的標志，Western blot 結果顯示，CIR后mbp的表達明顯減少，說明有腦白質髓鞘損傷，而給予BCP治療后，mbp的表達上升，結果表明BCP對CIR后小鼠白質損傷具有保護作用。

Fig 5 Effect of BCP on expression of mbp, NF and caspase-3apoptosis-related proteins in CIR mice n=5)

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsCIR

此外，CIR后小鼠白質抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯減少，促凋亡蛋白Bax、caspase-3表達升高，而BCP則促進Bcl-2表達，降低Bax、caspase-3表達，提示BCP對腦白質的保護作用可能與Bax/Bcl-2凋亡機制有關，但具體的作用機制還需要進一步的探討。本實驗BCP共設置了3個濃度梯度，分別為36、72、144 mg·kg-1，實驗結果顯示，BCP 72 mg·kg-1為最佳劑量組，36 mg·kg-1與144 mg·kg-1劑量效果不明確，總體上36 mg·kg-1較144 mg·kg-1效果好，可能原因是144 mg·kg-1用藥劑量過大，配藥所用溶劑選用的是蓖麻油，會對小鼠胃腸道產生刺激，實驗過程中體重減輕，對缺血/再灌損傷的耐受下降。

綜上所述，BCP能夠改善CIR小鼠腦白質上述病理學變化，對其起到保護作用，可能與抑制Bax/Bcl-2凋亡通路有關。盡管缺血性白質疾病具有較高發(fā)病率和重要臨床意義，但相對較少的努力投入到病理機制或尋找缺血性白質疾病的治療靶點的研究上[15]。因此，有必要進一步探討B(tài)CP對CIR小鼠腦白質的作用機制，對治療腦缺血/再灌注導致的白質損傷具有重要意義。