蛇床子素通過抑制髓核致炎大鼠脊髓背角CXCL1/CXCR2的表達發揮抗炎鎮痛作用

高鳳嬌，楊 琳，張嘉明，魏 明，賀秋蘭，鄒學農，孫來保

(1. 中山大學附屬第一醫院麻醉科，廣東 廣州 510080；2. 廣州市番禺中心醫院麻醉科，廣東 廣州 511400；3. 中山大學附屬第六醫院麻醉科，廣東 廣州 510655；4. 中山大學附屬第一醫院脊柱外科，廣東 廣州 510080；5. 廣東省骨科學重點實驗室，廣東 廣州 510080)

目前，腰椎間盤突出癥是導致慢性腰腿痛最常見的原因之一。據資料表明，約2%～3%的人口長期存在慢性腰腿痛現象，且腰腿痛是導致全球各地區勞動力喪失的首要原因[1]。臨床上一部分腰椎間盤突出癥的患者，腰椎MR檢查結果顯示椎間盤無或僅僅少量突出，影像學上無明顯的神經壓迫征象，但患者的腰腿痛癥狀卻非常明顯，那么我們考慮這部分腰椎間盤突出癥患者的腰腿疼痛主要是由于腰椎間盤突出的髓核組織引發的神經根炎癥，有效控制炎癥反應可以顯著降低神經根性痛的發病率和疼痛程度[2]。但對于這部分患者目前具體的神經根疼痛機制不完全清楚且有效控制炎癥的方法尚不完善。

CXCL1是中性粒細胞趨化因子，通過激活相應受體CXCR2并與之結合后產生促炎效應。近年來研究[3-5]表明，CXCL1/CXCR2在骨癌痛、化療藥物致疼痛及坐骨神經損傷致慢性疼痛的發生發展中均起到重要作用，但在腰椎間盤突出致慢性腰腿痛的發生過程中研究較少且機制不清楚。蛇床子素(osthole，Ost)是一種從中藥蛇床子中提取的單體，研究表明其有良好的抗炎鎮痛作用，課題組前期研究也表明Ost能有效緩解髓核致炎大鼠的神經根炎性疼痛[6,7]，但目前Ost對大鼠髓核源性神經根痛的抗炎鎮痛作用機制尚不完全明確。故本實驗擬采用自體髓核致神經根痛大鼠模型，探索CXCL1/CXCR2在大鼠神經根痛的發生發展中的作用機制，同時闡明Ost治療髓核源性神經根痛的機制，及為臨床上非手術治療的腰椎間盤突出癥患者開發更有效的抗炎鎮痛藥物提供實驗理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級SD大鼠,♂，124只，體質量(200～250)g，許可證號:SCXK(粵)2016-0029。大鼠飼養室溫度(23±2)℃、濕度(55±5)% 、噪音<85 dB，提供12 h/12 h白天和黑夜循環照明，本實驗所有動物操作均嚴格按照中山大學動物保護和使用規定。

1.2 試劑及儀器Ost(批號:S2337，Selleckchem，美國)；10%二甲亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO，Sigma，美國)；兔抗大鼠CXCL1一抗(AF5403，Affinity)；兔抗大鼠CXCR2一抗(ab14935，abcam，美國)；兔抗大鼠GAPDH一抗(AF7021，Affinity)；山羊抗兔二抗(ab6721，abcam，美國)；CXCL1中和抗體(AF-515，R&D Systems)；逆轉錄試劑盒(RR036A,TaKaRa公司)；PCR擴增試劑盒(RR820A,TaKaRa公司)；聚乙烯管PE導管(OD：0.5 mm，ID：0.25 mm，寧波安來軟件科技有限公司)；Von Frey纖毛儀( Stoelting公司，美國)；醫用顯微手術電鉆(XSZ-G-1型，上海光電技術有限公司)。

1.3 動物模型建立、分組及處理

1.3.1動物模型建立 ① 髓核致炎組:用2%戊巴比妥麻醉大鼠(40～50 mg·kg-1，ip.)后，將其俯臥位固定于操作臺上。大鼠備皮后消毒鋪巾，于兩髂嵴最高點連線中點做縱向3 cm左右切口，分離背部肌肉后，用醫用顯微手術電鉆在左L5半椎板上鉆孔，輕柔地將大鼠左側L5背根神經節(dorsal root ganglion，DRG)暴露，注意勿損傷神經，再從尾骨椎體上摘取約0.4 mg的髓核通過L5椎板孔放置于左L5背根神經根上(Fig 1)，從L5椎板鉆孔處將PE-10導管向頭側硬膜外腔輕柔置入約4 mm，并將其固定于同側肌肉組織，另一端經皮下隧道從頸后引出，回抽無血和腦脊液流出，止血充分后逐層縫合傷口。②假手術組:取出大鼠尾部自體髓核，但不將其置于L5被根神經節上，其余手術操作同髓核致炎組。③空白組:不作任何手術處理。

1.3.2分組及處理 第一部分：將60只♂ SPF級大鼠隨機分為3組: 髓核致炎組(NP，n=36)、假手術組(Sham，n=12)、空白組(Blank，n=12)。用up-dwon方法檢測大鼠術前1 d，術后3、7、14、21、28 d的50%機械縮足閾值(50% mechanical withdrawal threshold，50% MWT)。Sham組于術后7 d，NP組于術后3、7、14、21、28 d每個時間點均取6只大鼠的L5節段脊髓背角。用q-PCR方法檢測脊髓背角CXCL1 mRNA、CXCR2 mRNA和TNF-α mRNA的相對含量；用Western blot方法檢測脊髓背角CXCL1和CXCR2蛋白相對濃度。第二部分：將64只♂ SPF級髓核致炎后大鼠隨機均分為4組(n=16): NP+NS組，于術后d 3經硬膜外腔給予生理鹽水50 μL；NP+DMSO組，于術后d 3經硬膜外腔給予10% DMSO 50 μL；NP+Ost組,于術后d 3經硬膜外腔給予82 mmol·L-1的Ost 50 μL，即每只大鼠1 mg Ost，溶于10% DMSO；NP+AF-515組，于術后d 3給予AF-515 8 μg,溶于10% DMSO。所有大鼠術前、術后、給藥后各時間點均進行疼痛行為學指標50% MWT的測定，于術后7 d取材，通過Western blot方法檢測脊髓背角CXCL1和CXCR2的相對蛋白濃度。

Fig 1 The schematic diagram of nucleus pulposus (NP)-evoked pain model of rat

A： Represents the lumbar vertebral processing schematic map; B：Represents the drilling treatment of the L5 lamina in rats,and exposing the L5 dorsal root ganglion— “↑”; C： Represents the removal of about 0.4 mg of nucleus pulposus from the caudal vertebra of rats.

1.4 行為學測試用改良后up-down方法檢測大鼠50%MWT。疼痛行為學測試時間于9 ∶00～16 ∶00進行，測試前所有大鼠均在試驗箱中適應30 min，安靜后以不同折力von Frey纖毛刺激大鼠左足足底，避開肉墊使之稍成S形，持續6 s～8 s。大鼠后肢迅速畏縮、撤回，認為是陽性反應。從1.4 g開始，每個強度反復刺激5次，將出現3次以上陽性反應的最小von Frey纖維強度定為大鼠的50%MWT，兩次刺激之間至少間隔約15 s。按以上的流程重復測量3次，取均值。

1.5 q-PCR檢測脊髓背角CXCL1 mRNA、CXCR2 mRNA及TNF-α mRNA的表達水平2%戊巴比妥(60～80 mg·kg-1，ip)深麻醉大鼠后在冰面上迅速取出L5節段脊髓背角組織，將組織研磨成粉末狀后放進勻漿器中，按TRIzol抽提法提取脊髓背角總RNA，再檢測RNA濃度和純度。取適量RNA為模板在逆轉錄試劑盒(RR036A，TaKaRa公司)及相應條件下得到cDNA。采用Primer5.0設計基因特異性引物，CXCL1引物序列：5′-GCAGACAGTGGCAGGGATTC-3′(上游),5′-CGACCATTCTTGAGTGTGGCTAT-3′(下游)；CXCR2引物序列：5′-GTTCTTTGCCCTGACCTTGCC-3′(上游)，5′-TGTACTTGTGGCGTGGACGAT-3′(下游)；TNF-α引物序列：5′-GCCACCACGCTCTTCTGTCTA-3′(上游)，5′-CGCTTGGTGGTTTGCTACGA-3′(下游)； GAPDH引物序列：5′-CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3′(上游),5′-GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3′(下游)。根據PCR擴增試劑盒(RR820A,TaKaRa公司)反應體系的相應條件進行預變性、變性、退火、延伸，計算每個樣本的循環閾值(Ct值)，運用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀配套的Bio-Rad CFX Manager Software1.6 數據分析軟件進行分析，采用2-ΔΔCt法來計算CXCL1 mRNA、CXCR2 mRNA和TNF-α mRNA的相對濃度。

1.6 Western blot檢測脊髓背角CXCL1、CXCR2的蛋白表達水平所有大鼠在相應時間點于冰上快速取出L5節段脊髓背角組織，將組織用顯微剪剪成小碎片，加入含有蛋白酶抑制劑(78439，Thermo Fisher)的組織裂解液(78510，Thermo Fisher)，然后依次進行超聲組織勻漿、水浴、及離心后取上清。根據目標蛋白分子量的大小選用10%或12%的SDS-PAGE凝膠進行電泳，Bio-Rad半干轉儀將蛋白轉至PVDF膜后用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別與CXCL1一抗(1 ∶1 000)，CXCR2一抗(1 ∶1 000)，GAPDH一抗(1 ∶1 000)置于4 ℃冰箱孵育過夜，然后與山羊抗兔二抗(1 ∶500)室溫下孵育2 h。將PVDF膜與ECL試劑反應后即刻顯影，用Image J 6.0軟件分析PVDF膜條帶的灰度值。實驗重復3次，將各樣品中CXCL1和CXCR2灰度值分別與相應內參GAPDH灰度值相除作為相應蛋白的相對含量。

2 結果

2.1 模型建立前后大鼠機械痛閾值的變化各組大鼠術前的50% MWT差異無統計學意義(P>0.05),Sham組50% MWT在術后d 3降低(P<0.05)，然后逐漸恢復至術前水平(P>0.05)；NP組術后各時間點50% MWT較術前明顯降低(P<0.05)；與Sham組相比，NP組術后各觀測時間點50% MWT明顯降低(P<0.05)。見Fig 2。

Fig 2 Variation of 50%MWT before and after surgery )

*P<0.05vspreoperative 50% MWT of NP group ;#P<0.05vssham group;△P<0.05vspreoperative 50% MWT of sham group

2.2 建模后不同時間點CXCL1 mRNA、CXCR2 mRNA 和TNF-α mRNA的表達情況與Sham組比較，NP組術后3、7、14、21、28 d各時間點NP組大鼠的脊髓背角CXCL1 mRNA，CXCR2 mRNA和TNF-α mRNA的表達量均明顯增加(P<0.05)。NP組TNF-α mRNA在術后d 3明顯升高(P<0.05)持續至術后14 d(P<0.05),之后稍有下降至術后28 d(P<0.05)；NP組CXCL1 mRNA和CXCR2 mRNA在術后3 d開始升高(P<0.05)，于術后14 d達高峰(P<0.05)。見Fig 3。

Fig 3 Expression of CXCL1 mRNA,CXCR2 mRNA and TNF-α mRNA in different groups of rats at different time

*P<0.05,#P<0.05,△P<0.05vssham group

2.3 建模后不同時間點CXCL1和CXCR2蛋白的相對表達情況與Sham組比較，NP組術后3、7、14、21、28 d各時間點大鼠脊髓背角CXCL1和CXCR2的蛋白相對表達量均明顯增加(P<0.01)。見Fig 4。

2.4 硬膜外腔給予髓核致炎大鼠不同藥物對機械痛的影響術前各組大鼠的50%MWT差異無統計學意義(P>0.05)，各組大鼠在術后d 3均出現50%MWT顯著下降，與術前比較差異有統計學意義(P<0.01)。各組髓核致炎大鼠術后d 3經硬膜外管給予等體積的不同藥物。NP+NS組大鼠的50%MWT在硬膜外注射生理鹽水(NS)前后無明顯變化(P>0.05)；NP+DMSO組大鼠的50%MWT在硬膜外注射DMSO前后無明顯變化(P>0.05)；NP+AF-515組大鼠的50%MWT較給藥前有所提高(P<0.05)，維持至給藥后12 h(P<0.05)；NP+Ost組大鼠的50%MWT較給藥前明顯提高(P<0.01)，治療效果持續至術后d 14(P<0.01)。給藥后各時間點，NP+NS組和NP+DMSO組的50%MWT差異無統計學意義(P>0.05)。NP+Ost組和NP+AF-515組的50%MWT較NP+DMSO組均明顯提高(P<0.05)，其中給藥后NP+AF-515組的50%MWT比NP+Ost組低(P<0.05)。見 Fig 5。

Fig 4 Expression of CXCL1/CXCR2 protein in different groups of rats at different time points after

A,B: Western blot results showed an increase of CXCL1 in the spinal cord after surgery on days 3,7,14,21 and 28. C,D: Western blot results showed an increase of CXCR2 in the spinal horn cord after surgery on days 3,7,14,21 and 28.**P<0.01vssham group.

2.5 髓核致炎大鼠硬膜外腔給予不同藥物后CXCL1/CXCR2蛋白的表達情況與NP+NS組(0.92±0.11)和NP+DMSO組(0.99±0.10)比較，NP+Ost組(0.49±0.07)大鼠脊髓背角中CXCL1蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)。NP+NS組和NP+DMSO組大鼠脊髓背角中CXCL1蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。與NP+NS組(1.02±0.05)和NP+DMSO組(1.00±0.11)比較，NP+Ost組(0.45±0.06)大鼠脊髓背角中CXCR2蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)。NP+NS組和NP+DMSO組大鼠術后d 7脊髓背角中CXCR2蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。見 Fig 6。

Fig 5 Effect of epidural application of different solutions on 50%MWT of rats with nucleus pulposus-induced hyperalgesia

“↑”: administration of different drugs.**P<0.01,*P<0.05vsNP+DMSO group.

3 討論

腰椎間盤突出髓核組織的致炎特性是非壓迫性腰椎間盤突出所致根性神經痛的重要機制之一[8]。自體髓核作為椎間盤中的“隔離抗原”，一旦椎間盤的突出后暴露被免疫系統識別，即可激發機體產生自身免疫反應，誘發炎癥，促使中性粒細胞、單核巨噬細胞等炎性細胞募集、增殖，釋放各種溶酶、炎癥細胞因子，引起神經根腫脹、空泡變性。課題組前期的動物模型研究證實，突出的髓核組織接觸神經根后大鼠產生明顯的痛覺過敏[9,10]。同時，腰椎間盤突出的髓核引發的非菌性炎癥與患者的腰腿痛臨床表現也有密切聯系[8]。研究表明，自體的髓核組織能夠引起硬脊膜和/或神經根的化學性炎癥，突出的椎間盤組織含有生化和/或免疫刺激物，可引起機體炎癥反應及免疫應激反應[11]。有效控制炎癥能夠明顯降低神經根性痛的發病率和炎癥反應的程度，這已成為國內外椎間盤突出癥致腰腿痛研究的重要方向[12]。

趨化因子是一種小的趨化細胞因子，可以控制白細胞和外周免疫和/或膠質細胞的遷移行為，同時趨化因子參與病理性疼痛的發生與發展，如炎癥和神經性疼痛。膠質細胞和神經細胞可以激活趨化因子來影響外周致敏和神經可塑性，從而調節疼痛過程。CXCL1是C-X-C趨化因子家族成員，其氨基末端含有Glu-Leu-Arg序列,是一個中性粒細胞的化學引誘物[13]。CXCL1主要由巨噬細胞和中性粒細胞產生，在中樞神經系統，CXCL1主要表達于星形膠質細胞。趨化因子CXCL1是CXCR2受體的有效激動劑[14]，后者屬于G蛋白偶聯受體-即7次跨膜受體，在中樞神經系統主要表達于神經元細胞。CXCL1蛋白的表達主要受NF-κB的調控，NF-κB是參與炎癥過程相關基因表達的重要轉錄因子[3]。在長春新堿致神經病理性疼痛的研究[4]中，通過靶向抑制CXCL1/CXCR2通路，可以明顯緩解小鼠的痛覺過敏。另外，CXCL1-CXCR2通路的活化介導小鼠骨癌痛的發生發展[3,15]。坐骨神經損傷的研究中，星形膠質細胞中CXCL1的激活在痛覺過敏的發生發展過程中也起到重要作用[5]。本實驗采用大鼠自體髓核致炎模型，髓核致炎組機械痛閾值在術后d 3開始降低，到d 7降至最低，可持續至術后d 28，且術后炎癥因子TNF-α mRNA的表達明顯升高，表明模型建立成功。通過取L5節段脊髓背角做q-PCR檢測發現，髓核致炎組大鼠脊髓背角CXCL1 mRNA、CXCR2 mRNA和TNF-α mRNA的表達較Sham組均明顯增加,Western blot實驗檢測到脊髓背角CXCL1和CXCR2的蛋白相對表達量也增加，說明髓核致炎模型大鼠的脊髓背角中存在CXCL1/CXCR2的活化增加。

Fig 6 Expression of CXCL1/CXCR2 in different groups of rats atdifferent time points after intrathecal injection of different solutions

**P<0.01vsNP+DMSO group.

為了進一步驗證CXCL1/CXCR2是否參與髓核致炎大鼠神經根痛的發生發展，在模型建立后d 3經硬膜外導管給予CXCL1的中和抗體(AF-515)，可觀察到大鼠的機械痛閾值升高，但持續時間僅12 h左右，其中在給藥后7 h出現較明顯的痛閾值增高。CXCL1中和抗體經硬膜外腔單次給藥可中和大鼠脊髓局部CXCL1，使得CXCL1激活相應受體CXCR2的量減少，同時與CXCR2的結合也減少，以發揮對CXCL1-CXCR2通路的阻斷效應，這可能是本實驗中AF-515改善大鼠機械性痛敏發揮抗炎效果的主要原因。因而，我們認為CXCL1-CXCR2可能參與了髓核致炎大鼠髓核源性神經根痛的發生發展。Ost是一種中藥單體，化學結構為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素，具有抗炎鎮痛的作用。在本實驗中，術后d 3經硬膜外導管給予Ost 1 mg，可明顯改善大鼠自體髓核誘發的機械性痛敏，且作用效果可以維持至術后d 14(給藥后d 11);在術后d 7(給藥后d 3)，NP+Ost組大鼠脊髓背角CXCL1和CXCR2蛋白均發生下調。因而，Ost能有效緩解髓核致炎大鼠的痛覺過敏，并伴有L5脊髓背角CXCL1/CXCR2蛋白表達明顯減少。本實驗的研究結果表明，抑制髓核致炎大鼠脊髓背角CXCL1/CXCR2的表達很可能是蛇床子素發揮抗炎鎮痛作用的重要機制之一。

NF-κB作為CXCL1蛋白生成的主要轉錄因子，調控CXCL1的生成與活化。本研究中僅探索了Ost對CXCL1-CXCR2通路的抑制作用，而Ost是否通過影響上游的轉錄因子NF-κB的活化來調控大鼠的痛覺過敏未進行深入研究。由于CXCl1中和抗體硬膜外腔單次給藥僅能短時間內抑制疼痛行為學，我們有理由再進一步探究CXCL1的上游調控體系，以完善Ost抗炎鎮痛的理論依據及探究Ost在髓核致炎大鼠中通過下調CXCL1/CXCR2表達的具體機制。

綜上，自體髓核置于L5神經根周圍誘導產生神經根炎癥和疼痛超敏反應后，大鼠脊髓背角中CXCL1/CXCR2的表達明顯增加，給予CXCL1中和抗體(AF-515)和蛇床子素后，大鼠行為學改善并且脊髓背角CXCL1/CXCR2的表達明顯下調。本研究證實大鼠脊髓背角中的CXCL1/CXCR2在髓核導致的神經根痛的發生發展中起到重要角色，且Ost可能通過抑制趨化因子CXCL1及其受體CXCR2的表達而緩解大鼠痛覺過敏。

(致謝：本實驗研究在廣東省廣州市中山大學第一附屬醫院骨科研究所完成，感謝各位老師和實驗室同事對本實驗的指導和幫助！)