塞來(lái)昔布通過(guò)c-Myc及Akt/mTORC1信號(hào)通路延緩c-Myc誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞癌的發(fā)展

莫雅斯，饒 輝，盛 磊，胡俊杰，鄭國(guó)華，2

(湖北中醫(yī)藥大學(xué) 1.藥學(xué)院、2.中藥資源與中藥復(fù)方教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室老年病中藥新產(chǎn)品湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430065)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)約占原發(fā)性肝癌的90%，是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具有預(yù)后不良、容易復(fù)發(fā)和死亡率高等特點(diǎn)。全球每年新患HCC人數(shù)約為75萬(wàn)人，其中50%發(fā)生于中國(guó)，嚴(yán)重危害著我國(guó)人民的生命健康[1]。但是，目前臨床上現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)化治療手段，如索拉菲尼等，僅能延長(zhǎng)患者生命3～4個(gè)月[2]。因此，尋找新的治療思路對(duì)于肝細(xì)胞癌患者具有重要的意義。

原癌基因c-Myc是一種轉(zhuǎn)錄子，能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化等大量基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化和發(fā)展。研究顯示，在人類(lèi)肝細(xì)胞癌樣本中常常伴隨著c-Myc的過(guò)表達(dá)和異常擴(kuò)增[3]，并且在小鼠肝細(xì)胞癌模型中c-Myc的表達(dá)與肝細(xì)胞癌的發(fā)展呈正相關(guān)[4]。因此，c-Myc可以作為肝細(xì)胞癌靶向治療的候選基因之一。蛋白激酶B(proteinkinase B，Akt)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素復(fù)合物1(mTOR complex 1，mTORC1)是腫瘤細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，在肺癌、肝癌[5,6]等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展以及參與血管形成等多種功能。

塞來(lái)昔布是環(huán)氧化酶-2的選擇性抑制劑，臨床上常用的一種非甾體抗炎藥。近年來(lái)，多項(xiàng)研究表明塞來(lái)昔布可以抑制多種腫瘤的發(fā)展，如乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等、口腔癌等[7-9]。但目前關(guān)于塞來(lái)昔布對(duì)肝細(xì)胞癌的作用及其機(jī)制研究還較少。Krysan 等[10]和Xia 等[11]報(bào)道，塞來(lái)昔布可以通過(guò)調(diào)節(jié)對(duì)前列腺素E2或Wnt/β-catenin通路影響其下游基因c-Myc的表達(dá)。Kucab等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，塞來(lái)昔布可以通過(guò)抑制Akt的磷酸化,破壞Akt信號(hào)通路。以上結(jié)果提示塞來(lái)昔布對(duì)c-Myc和Akt通路具有一定的作用，但其是否能夠通過(guò)c-Myc及Akt/mTORC1信號(hào)通路影響肝細(xì)胞癌的發(fā)展尚未有報(bào)道。本研究采用尾靜脈高壓注射法在小鼠體內(nèi)過(guò)表達(dá)c-Myc建立肝細(xì)胞癌模型，觀察塞來(lái)昔布對(duì)小鼠肝細(xì)胞癌發(fā)展的作用及其機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器小鼠固定架(Braintree Scientific INC)；低速離心機(jī)(德國(guó)艾本德)；恒溫?fù)u床(Thermo Scientific)；純水儀(EASY pure UF 07421,Millipore)；顯微鏡(日本 OLYMPUS BX53)；圖像采集系統(tǒng)(日本 OLYMPUS)；酶標(biāo)儀(美國(guó) Bio Rad 公司 )；電泳儀(美國(guó) Bio Rad 公司)；漩渦混合器(美國(guó) Scientific Industries 公司)；轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó) Bio Rad 公司) 。

1.2 藥品與試劑c-Myc質(zhì)粒(CHENXIN實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)；Top10 感受態(tài)細(xì)胞(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司 03690)；質(zhì)粒大提試劑盒(美國(guó) OMEGA D6926)；免疫組化試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司20422)；p-Akt T308抗體(#13038)、 p-Akt S473抗體(#4060)、p-4EBP1(#2855)均購(gòu)自CST公司；c-Myc抗體(10828-1-AP)；β-actin(HRP-6008)及二抗(SA00001-2)購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；塞來(lái)昔布(輝瑞制藥有限公司 J20140072)；PVDF 膜(美國(guó) Millipore公司 R9EA33171) 。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)野生型FVB/N小鼠28只，♀，6～7周齡，體質(zhì)量(18～20) g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0002。

2 方法

2.1 c-Myc誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞癌模型的制備按照質(zhì)粒提取試劑盒步驟提取 c-Myc基因質(zhì)粒及編碼 Sleeping Beauty 轉(zhuǎn)座酶的質(zhì)粒SB。將c-Myc 基因質(zhì)粒與SB質(zhì)粒按25 ∶1的稀釋比例，稀釋到 0.9%氯化鈉溶液中，渦旋混勻，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，將配置好的質(zhì)粒經(jīng)小鼠尾靜脈迅速(5～9 s)注射入小鼠體內(nèi)。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和給藥適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將小鼠隨機(jī)分為4組，分別為正常組(WT)，c-Myc模型組，塞來(lái)昔布低、高劑量組，每組7只。模型組和給藥組按“2.1項(xiàng)”下方法進(jìn)行小鼠高壓尾靜脈注射c-Myc質(zhì)粒，正常組高壓尾靜脈注射生理鹽水作為對(duì)照。各組藥物溶液均以水為溶劑配制，現(xiàn)配現(xiàn)用，用前搖勻。造模3 d后塞來(lái)昔布低、高劑量組每天灌胃塞來(lái)昔布一次，給藥劑量分別為150 mg·kg-1(c-Myc-Cele-L)、300 mg·kg-1(c-Myc-Cele-H)；正常組和c-Myc模型組灌胃等體積空白溶劑，連續(xù)給藥6周。

2.3 樣本收集實(shí)驗(yàn)小鼠在最后一次給藥3 h后，以頸椎脫臼法處死小鼠，解剖，取出完整肝臟組織；拍照并記錄肝重，計(jì)算肝臟指數(shù)(肝臟指數(shù)=肝重/體重)；取部分肝組織用多聚甲醛(4%)固定供組織病理分析；剩余肝臟組織-80 ℃保存。

2.4 蘇木精-伊紅(HE)檢測(cè)將在多聚甲醛中固定24 h后的肝組織轉(zhuǎn)移至75%的酒精中，經(jīng)自動(dòng)組織脫水機(jī)脫水、透明處理，在石蠟包埋機(jī)中浸蠟、包埋，進(jìn)行厚5 μm 切片，37 ℃水浴展開(kāi)、撈片、瀝干、常規(guī)HE染色，在顯微鏡下觀察各組小鼠組織病理學(xué)變化。

2.5 IHC檢測(cè)將包埋后的小鼠肝臟組織切成5 μm厚度切片，按免疫組化試劑盒操作步驟，檢測(cè)Ki67蛋白表達(dá)情況。

2.6 Western Blot檢測(cè)取出-80 ℃凍存的肝臟組織適量，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，超聲破碎后置于冰上充分裂解15 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min，然后吸取上清，采用BCA法測(cè)蛋白濃度。以等量總蛋白上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，置于c-Myc、p-Akt T308、p-Akt S473、p-4EBP1(稀釋比例1 ∶1 000)或β-actin(稀釋比例1 ∶10 000)單克隆抗體溶液中4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜10 min×3，相應(yīng)二抗(稀釋比例1 ∶8 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3，ECL顯色后，成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光。用Image J 1.8.0軟件進(jìn)行分析，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參(β-actin)灰度值的比值進(jìn)行評(píng)價(jià)。

3 結(jié)果

3.1 塞來(lái)昔布對(duì)c-Myc誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞癌模型肝臟形態(tài)學(xué)、肝重、肝臟指數(shù)的影響各組小鼠肝臟形態(tài)學(xué)變化，如Fig 1A所示。WT組小鼠肝臟外觀呈現(xiàn)鮮紅色，表面光滑質(zhì)地均勻；c-Myc誘導(dǎo)小鼠肝臟體積明顯增大，肝臟組織出現(xiàn)大量白色結(jié)節(jié)；與c-Myc誘導(dǎo)小鼠相比，c-Myc-Cele-L和c-Myc-Cele-H小鼠肝臟體積明顯減小，肝臟組織白色結(jié)節(jié)變少。

如Fig 1B、C所示，與WT相比，c-Myc模型組小鼠肝重和肝臟指數(shù)均明顯增高(P<0.01)；與c-Myc模型組相比，c-Myc-Cele-L和c-Myc-Cele-H小鼠肝臟重量和臟器指數(shù)均明顯降低(P<0.05,P<0.01)，并且呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。

3.2 塞來(lái)昔布對(duì)c-Myc誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞癌模型肝臟組織的病理學(xué)影響Fig 2的HE染色結(jié)果顯示，WT小組小鼠組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核清晰且均勻分布，胞漿豐富；c-Myc模型組小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞核排列緊密且分布散亂(多核、固縮)，幾乎不見(jiàn)胞質(zhì)； c-Myc-Cele-L和c-Myc-Cele-H小鼠肝臟組織病變減輕，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較清晰，細(xì)胞核變小、多核細(xì)胞明顯減少，肝細(xì)胞內(nèi)充滿少量胞質(zhì)，且c-Myc-Cele-H組腫瘤病變區(qū)域外可見(jiàn)正常組織區(qū)域。

3.3 塞來(lái)昔布對(duì)c-Myc誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞癌模型肝臟組織中Ki67蛋白表達(dá)的影響Ki67在多種惡性腫瘤中呈過(guò)表達(dá)現(xiàn)象。其與細(xì)胞有絲分裂密切相關(guān)，是評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞是否異常增殖的有效指標(biāo)。Fig 3的Ki67免疫組化染色結(jié)果顯示，與WT比較，c-Myc模型組可見(jiàn)大量細(xì)胞核Ki67陽(yáng)性染色；與c-Myc模型組相比， c-Myc-Cele-L和c-Myc-Cele-H組Ki67陽(yáng)性染色明顯減少，并且呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。

3.4 塞來(lái)昔布對(duì)c-Myc誘導(dǎo)小鼠肝臟組織中c-Myc蛋白表達(dá)的影響在c-Myc誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞癌模型中，c-Myc對(duì)肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展具有重要影響，因此我們檢測(cè)了小鼠肝臟中c-Myc的表達(dá)。如Fig 4所示，c-Myc組小鼠肝臟組織中c-Myc蛋白表達(dá)與WT組比較明顯增高(P<0.01,P<0.01)；與c-Myc組小鼠相比，塞來(lái)昔布干預(yù)后(c-Myc-Cele-L和c-Myc-Cele-H)小鼠肝臟組織中c-Myc表達(dá)量明顯降低(P<0.05,P<0.01)。

3.5 塞來(lái)昔布對(duì)c-Myc誘導(dǎo)小鼠肝臟組織中p-Akt T308、p-Akt S473、p-4EBP1蛋白表達(dá)的影響如Fig 5 所示，與WT相比，c-Myc組小鼠肝臟組織中p-Akt T308、p-Akt S473、p-4EBP1蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.05)；與c-Myc組相比，塞來(lái)昔布干預(yù)后(c-Myc-Cele-L和c-Myc-Cele-H)小鼠肝臟組織中上述蛋白表達(dá)量均明顯降低(P<0.01)。

Fig 1 Effects of celecoxib on liver gross image (A),hepatic weight (B) and liver index (C) in

##P<0.01vsWT,*P<0.05,**P<0.01vsc-Myc

Fig 2 Effect of celecoxib on pathological changes of liver tissues(scale bar=100 μm)

Fig 3 Effect of celecoxib on distribution of Ki67 by immunohistochemistry(scale bar=50 μm)

Fig 4 Effect of celecoxib on expression of c-Myc protein in mouse liver

##P<0.01vsWT;**P<0.01vsc-Myc

Fig 5 Effect of celecoxib on expression of p-Akt T308,p-Akt S473 and p-4EBP1 in mouse liver

#P<0.05,##P<0.01vsWT,*P<0.05,**P<0.01vsc-Myc

4 討論

HCC是一種高致死率的腫瘤，其發(fā)病率逐漸上升，目前仍缺乏有效的治療方法。因此，迫切需要尋找新的治療手段來(lái)治療肝細(xì)胞癌。塞來(lái)昔布臨床上主要用于緩解骨關(guān)節(jié)炎、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎以及成人急性疼痛等，近年來(lái)研究顯示其具有強(qiáng)大的抗腫瘤活性。Liu等[13]發(fā)現(xiàn)，塞來(lái)昔布能夠抑制IL-6/IL-6受體誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞癌的JAK2/STAT3磷酸化。Tang等[14]研究表明，塞來(lái)昔布可以通過(guò)阻滯細(xì)胞周期抑制肝細(xì)胞癌的發(fā)展。但塞來(lái)昔布對(duì)肝細(xì)胞癌的作用及其機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。本研究采用高壓尾靜轉(zhuǎn)染技術(shù)在小鼠體內(nèi)過(guò)表達(dá)c-Myc，能激活A(yù)kt/mTORC1信號(hào)通路，并在6～7周迅速形成肝細(xì)胞癌模型[15]。該造模方法具有成模率高、造模周期短等特點(diǎn)，并已廣泛運(yùn)用于多種肝臟疾病的研究。結(jié)果表明，塞來(lái)昔布干預(yù)能夠明顯的減少c-Myc誘導(dǎo)小鼠的肝重和肝臟指數(shù)。說(shuō)明塞來(lái)昔布能夠延緩c-Myc誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞癌發(fā)展。

為進(jìn)一步明確塞來(lái)昔布對(duì)c-Myc誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞癌的作用，我們通過(guò)HE和IHC檢測(cè)塞來(lái)昔布對(duì)小鼠肝細(xì)胞癌的影響。結(jié)果顯示，在HE染色中，c-Myc誘導(dǎo)小鼠肝臟組織病變明顯，細(xì)胞核排列緊密且分布散亂(多核、固縮)，幾乎不見(jiàn)胞質(zhì)；塞來(lái)昔布干預(yù)后上述現(xiàn)象明顯改善，且高劑量組腫瘤病變區(qū)域外可見(jiàn)正常組織區(qū)域。IHC實(shí)驗(yàn)中，c-Myc誘導(dǎo)小鼠肝臟組織腫瘤區(qū)增殖標(biāo)記物Ki67表達(dá)水平明顯升高，塞來(lái)昔布干預(yù)后Ki67表達(dá)水平下降。提示塞來(lái)昔布可能通過(guò)抑制c-Myc誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞癌的增殖來(lái)延緩肝細(xì)胞癌的發(fā)展，但其抑制小鼠肝細(xì)胞癌異常增殖的作用機(jī)制并不清楚。

腫瘤細(xì)胞的異常增殖不僅受細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)的影響，它還通過(guò)影響細(xì)胞生長(zhǎng)周期和細(xì)胞凋亡等方式來(lái)避免細(xì)胞進(jìn)入最終的分化過(guò)程。c-Myc是一種多功能核磷蛋白，屬于堿性螺旋環(huán)螺旋亮氨酸拉鏈家族,通過(guò)調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)等影響肝細(xì)胞癌的發(fā)生與發(fā)展。研究表明，抑制c-Myc的表達(dá)可抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞系(HCC-9204、HepG2等)的增殖。Akt在細(xì)胞的存活和凋亡中起著重要作用，p-Akt T308、p-Akt S473是Akt的活性形式。Akt的活化可以激活其主要下游靶點(diǎn)mTORC1。mTORC1是細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝和生存的主要調(diào)節(jié)因子。mTORC1的激活可以磷酸化真核細(xì)胞翻譯起始子4E 結(jié)合蛋白 1(e IF4E-binding protein 1，4EBP1)，從而調(diào)節(jié)蛋白合成，影響腫瘤異常增殖。本研究Western blot結(jié)果顯示，c-Myc誘導(dǎo)小鼠肝臟中c-Myc、p-Akt T308、p-Akt S473、p-4EBP1蛋白的表達(dá)量明顯升高，說(shuō)明c-Myc以及Akt/mTORC1信號(hào)通路在肝細(xì)胞癌模型中被激活，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。塞來(lái)昔布可以抑制該模型小鼠肝臟組織中c-Myc、p-Akt T308、p-Akt S473、p-4EBP1蛋白的表達(dá)水平。以上結(jié)果說(shuō)明，塞來(lái)昔布可能通過(guò)調(diào)控c-Myc和Akt/mTORC1信號(hào)通路來(lái)抑制小鼠肝細(xì)胞癌的增殖。

綜上所述，塞來(lái)昔布能通過(guò)抑制c-Myc誘導(dǎo)的小鼠肝細(xì)胞癌的增殖來(lái)延緩肝細(xì)胞癌的發(fā)展，其作用機(jī)制可能與塞來(lái)昔布能調(diào)控c-Myc和Akt/mTORC1信號(hào)通路有關(guān)。本研究通過(guò)c-Myc誘導(dǎo)的小鼠肝細(xì)胞癌模型闡明了塞來(lái)昔布對(duì)肝細(xì)胞癌新的作用機(jī)制，為肝細(xì)胞癌的預(yù)防與治療提供了新的思路。