特應性皮炎患者外周血外泌體調控HaCaT細胞活化及炎癥的研究

韓 悅 姚 煦

中國醫學科學院北京協和醫學院皮膚病研究所，南京，210042

特應性皮炎(atopic dermatitis，AD)是常見的慢性復發性炎癥性皮膚病,多見于兒童,常伴食物過敏、過敏性鼻炎和哮喘,患者劇烈瘙癢,嚴重影響生活質量,是皮膚科最受關注的疾病之一[1,2]。近20年世界范圍內特應性皮炎的發病率迅速增高,西方發達國家兒童特應性皮炎的發病率約為10%～20%[3]。近年報道我國多城市兒童特應性皮炎發病率為12.94%。AD的發生與多種細胞息息相關，其中，角質形成細胞(keratinocytes，KC)至關重要，其活化與炎癥在AD中扮演著關鍵性的角色。目前發病機制尚未完全明確，故特應性皮炎的治療仍非常困難[4]。因此,積極探索特應性皮炎的發病機制具有非常重要的意義。

外泌體是活細胞分泌的來源于晚期核內體的膜性囊泡，直徑約為30～150 nm[5]。它天然存在于血液、唾液、尿液和母乳等體液中[6]。外泌體1980年首次被發現，當時被認為是細胞排泄廢物的一種方式，如今隨著研究深入，外泌體運輸功能，特異靶向受體細胞，交換蛋白和脂類或引發下游信號傳導參與細胞間通訊等功能逐漸被揭示[7]。不同組織細胞來源的外泌體由于攜帶的蛋白質不同，從而發揮不同的生物學功能[8]。外泌體除含有蛋白外，還含有各種非編碼RNA，如microRNAs等，參與基因的表達調控[9]。

目前為止，外泌體關于AD方面鮮有報道。因此我們嘗試通過檢測AD患者外周血中外泌體來研究其對KC的調控作用。此文基于傳統實驗方法擬探討AD患者外周血外泌體調控HaCaT細胞的活化及炎癥，為AD的診斷和發病機制提供一些理論指導。

1 材料與方法

1.1 一般資料 資料概況：本次臨床研究均獲受試者及其家屬知情并簽署知情同意書。選取2017年5月至2018年5月期間中國醫學科學院皮膚病醫院就診的AD患者和同期健康人的外周血標本各30例為研究對象，并記錄患者的年齡、性別。AD患者中位數年齡為17.04歲，男/女比例為1.14，健康人年齡中位數為21.63歲，男/女比例為1.31，所有外周血標本均于清晨空腹采集。

納入標準： 符合AD的William診斷標準，年齡介于18～70歲，無其他嚴重疾病者。

排除標準：伴有其他皮膚病，心肝腎功能不全，臨床及隨訪資料不全。

1.2 exoEasy Maxi Kit試劑盒提取外泌體 預先過濾細胞培養上清，將大于0.8 μm的微粒全部除去，將buffer XBP加入到等體積樣品中，試管上下震蕩5次，室溫混合。將上述混合液結合在核酸純化柱上離心500 g 1 min，棄上清，將柱子復原至同一個接受管中。加入10 mL buffer XWP 5000 g離心5 min以去除殘余buffer，棄上清及接受管。轉移核酸純化柱至一個新的接受管。加入400 μL～1 mL bufferXE至膜上孵育1 min，離心500g 5 min，收集洗脫液。再次將洗脫液加入至exoEasy核酸純化膜中，并孵育1 min，離心5000 g 5 min，收集洗脫液轉移至凍存管，置于-80℃冰箱內保存備用。

1.3 外泌體驗證

1.3.1 電鏡驗證 外泌體戊二醛固定。清洗：用1 mL PBS清洗3次，每次靜置15 min。鋨酸固定：加入0.5 mL 2%鋨酸溶液 4度固定2 h。清洗：用1 mL PBS清洗3次，每次靜置15 min。脫水：用50%、70%、80%、90%乙醇各1 mL梯度脫水分別靜置15 min，再用1 mL 100%乙醇脫水2次，每次20 min。置換：用1 mL丙酮置換2次，每次靜置15 min。浸漬。包埋：將樣品放入盛有純包埋劑的包埋板中。聚合：將包埋板置于65℃條件下聚合48 h。染色：醋酸雙氧鈾染色10 min后清洗；醋酸鉛染色10 min后清洗。上機檢測。

1.3.2 外泌體粒徑分析(nanoparticle tracking analysis，NTA) 采用NTA檢測提取物粒徑大小，若介于30～200 nm之間，即為外泌體提取成功。

1.4 CCK-8法檢測HaCaT增殖 實驗采用CCK8法檢測各組細胞于轉染后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h時間點的增殖情況。將三組細胞調整至1.0×105/孔，取100 μL/孔在96孔板中接種，放置于培養箱中培養。每孔加入20 μL的CCK-8溶液(APExBIO，USA)，將培養板在培養箱內孵育1～4 h，不用清洗，直接用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。每組設6個副孔，重復三次。

1.5 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡 將轉染后的細胞培養48 h，用0.25%胰酶消化細胞后血清終止消化，離心300 g 5 min收集細胞。用冰PBS清洗細胞一次，300 g離心5 min。加入300 μL的1×Binding Buffer 懸浮細胞。加入5 μL的Annexin V-FITC(BD，USA)混勻后，避光，室溫孵育15 min。上機前5 min再加入5 μL的PI染色。

1.6 HaCaT細胞RNA的檢測

1.6.1 試劑盒提取總RNA 使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN，德國)試劑盒提取血清中總RNA，操作步驟按照說明書進行。首先將兩組人群的全血離心2000 g 3 min，加入Buffer RLT震蕩混勻，將液體移入到2 mL的收集管內離心2 min，加入一倍體積的70%乙醇，混勻，移出700 μL混合物到Rneasy收集柱，10000 rpm離心15 s，倒掉濾液，向柱子中加入700 μL的Buffer RW1，10000 rpm離心15 s，倒掉濾液，向柱子中加入500 μL Buffer RPE 10000 rpm離心15 s，倒掉濾液，向柱子中加入500 μL Buffer RPE蓋上蓋子，大于10000 rpm離心2 min，將柱子移入到一個新的2 mL收集管內，全速離心1 min，將柱子移入到一個新的1.5 mL 收集管內，加入30 μL的無Rnase water，10000 rpm離心1 min，重復一次，收集濾液。分光光度計檢測RNA濃度和OD值，-80℃備用。

1.6.2 熒光定量-PCR(q-PCR)檢測細胞中RNA的表達 首先利用primer 5.0進行引物設計，采用miScript Reverse Transcription Kit試劑盒(QIAGEN，德國)將提取出來的總RNA逆轉錄合成cDNA，反應體系為20 μL，反應條件為37℃ 60 min，95℃ 5 min。以cDNA為模板，利用SYBR?Green PCR Kit(QIAGEN，德國)進行PCR 擴增，反應體系為20 μL，反應條件為95℃ 15 min，1循環；95℃ 15 s，55℃ 30 s，60℃ 30 s，40個循環。以GAPDH作為實驗的內參基因，相對表達量以2-△△Ct形式表示，其中△CT=CT(目的基因)-CT(GAPDH)(表1)。

表1 各mRNA引物序列

1.7 統計學方法 文中實驗結果數據在SPSS 20.0軟件中統計分析，統計圖在Graghpad Prism 7軟件中繪制和編輯加工，采用獨立t檢驗分析兩組獨立樣本間的均數差異，采用ANOVA檢驗進行多組間均數差異的比較。實驗數據中計量資料以均數±標準差表示,P<0.05為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 外泌體對HaCaT細胞的增殖的影響 將0 g/L、20 g/L、40 g/L、80 g/L蛋白濃度的正常人-外泌體分別與HaCaT細胞共培養，采用CCK-8法檢測各組細胞的0 h、6 h、12 h、24 h、48 h時間點的增殖情況。與對照組相比，各濃度正常人-外泌體組在12 h、24 h、48 h時間點細胞增殖水平均明顯降低(均P<0.001)，40 g/L外泌體組尤為明顯(圖1、表2)。

NC：不加外泌體組；EXO20：蛋白濃度20 g/L外泌體組；EXO40：蛋白濃度40 g/L外泌體組；EXO80：蛋白濃度80 g/L外泌體組

圖1CCK-8檢測各組細胞的增殖情況

2.2 外泌體對HaCaT細胞的凋亡的影響 將0 g/L、20 g/L、40 g/L、80 g/L蛋白濃度的正常人-外泌體分別與HaCaT細胞共培養48 h，采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測各組細胞的凋亡情況。0 g/L、20 g/L、40 g/L、80 g/L外泌體組細胞的凋亡率分別是2.53±0.3、14.53±2.6、17.12±2.2、12.12±1.2，與對照組相比，各濃度外泌體組細胞凋亡水平均明顯升高，組間差異有統計學意義(P<0.001)。凋亡實驗結果中40 g/L外泌體組尤為顯著(圖2)。

2.3 外泌體驗證 為了驗證從外周血上清中分離的提取物是外泌體，我們用了兩種方法—電鏡與NTA。透射電鏡下觀察到均一的微小囊泡，NTA鏡下觀察到提取物粒徑在3 nm與200 nm之間，即為外泌體分離成功(圖3、4)。

表2 CCK-8法檢測各濃度外泌體加入HaCaT細胞的增殖情況

NC：不加外泌體組；EXO20：蛋白濃度20 g/L外泌體組；EXO40：蛋白濃度40 g/L外泌體組；EXO80：蛋白濃度80 g/L外泌體組

2.4 外泌體對HaCaT細胞的調控作用 根據加入外泌體情況分為三組：AD-外泌體組、正常人-外泌體組和對照組，利用q-PCR檢測各組細胞的活化(K16)、分化(K10、IVL)、炎癥指標(TSLP、IL-25、IL-33、CXCL1、CXCL2)。結果顯示，較于正常人-外泌體組和對照組，AD-外泌體組中K16、K10、IVL，TSLP、IL-25、IL-33、CXCL2表達上調(P<0.05)，CXCL1表達水平無統計學差異(P>0.05)(圖5)。

NC：不加外泌體組；EXO20：蛋白濃度20 g/L外泌體組；EXO40：蛋白濃度40 g/L外泌體組；EXO80：蛋白濃度80 g/L外泌體組

圖2流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況

圖3 透射電鏡下外泌體結構(×400) 圖4 NTA檢測外泌體粒徑大小 4a：外泌體粒徑檢測；4b：外泌體粒徑三維模式圖

NC：未加入外泌體的對照組；NH-EXO：加入蛋白濃度為40 g/L的正常人外泌體組；AD-EXO：加入蛋白濃度為40 g/L的AD外泌體組

圖5qPCR法檢測各組細胞的細胞因子的表達差異

3 討論

特應性皮炎表現為皮膚增厚、瘙癢，有明顯的家族遺傳傾向，易患哮喘、過敏性鼻炎等過敏性疾病。大多從幼時發病，皮損遷延不愈、瘙癢劇烈，甚至影響患兒的身心健康[9-11]。目前，AD的發病機制尚不明確。因此，探索有關AD發生發展的分子標記具有重要意義。如果能利用現代實驗手段找出AD患者中的一些表達差異的生物標記物，那么對AD的早期治療具有非常重要的科學價值。隨著分子生物學、免疫學等基礎學科的迅猛發展，對AD的研究日益深入，

多種與AD的發生發展密切相關的生物標記物被發現，外泌體即是其中之一[12]。

近期多項研究揭示了各種來源的外泌體對KC的多種調控作用。Zhang等[13]的研究解釋了肥胖者傷口愈合速度比正常人慢的現象，脂肪細胞源性外泌體通過直接與PUM2結合，促進其介導的NF-kB通路激活，進而誘導人KC炎癥和凋亡。最近一項研究[14]顯示，泛發性膿皰性銀屑病中性粒細胞源外泌體較正常中性粒細胞誘導KC中IL-1β、IL-36、IL-18、TNF-α和C-X-C基序趨化因子配體等炎癥基因的高表達。此外，患者的中性粒細胞比對照組分泌更多的外泌體，后被KC迅速內化，通過激活NF-kB和MAPK信號通路增加這些炎癥分子的表達。綜上研究，脂肪細胞和中性粒細胞源外泌體可以調控人KCs的增殖、凋亡和炎性因子的分泌，從而影響疾病的發生發展。基于以往研究，我們在本試驗中擬探索AD患者外周血中外泌體能否對KC的活化、炎癥產生影響。

首先收集我院AD患者和健康人的外周血樣本各30例并分離血漿中外泌體，采用電鏡與NTA來進行外泌體的結構驗證，然后進行外泌體的功能研究：將不同蛋白濃度的外泌體分別與HaCaT細胞共培養，檢測各組細胞的增殖、凋亡情況，目的是找出外泌體對細胞增殖凋亡的影響和它的最佳刺激濃度。結果發現，加入正常人-外泌體后的細胞增殖率較對照組顯著降低、凋亡率明顯升高；其中，加入40 g/L蛋白濃度刺激后的差異尤為顯著。因此我們將該濃度的外泌體進行后續實驗研究。根據加入外泌體情況將HaCaT細胞分為AD-外泌體組、正常人-外泌體組和對照組，檢測三組細胞的活化(K16)、分化(K10、IVL)、炎癥(TSLP、IL-25、IL-33、CXCL1、CXCL2)指標。結果顯示，較正常人-外泌體組和對照組，AD-外泌體組中K16、K10、IVL、TSLP、IL-25、IL-33、CXCL2表達升高，而CXCL1差異無統計學意義。所以，AD-外泌體可以促進KC的增殖和炎癥因子的分泌。得出結論：AD患者外周血外泌體可以抑制KC的凋亡并促進KC的增殖、活化及炎癥因子的分泌，從而參與AD的發生發展。

在設計方面該實驗有一定的不足之處，因各種客觀因素，樣本量較少，從而對研究結果產生一定的影響，后期有條件可適當對樣本量進行擴充。此外，細胞實驗中我們選用了人正常角質形成細胞系HaCaT，值得說明的是，細胞株與人體細胞間畢竟具有一定的變異性，目前兩者差異能否對實驗結果構成影響尚不明確。重要的是，外泌體中影響人KC活化、炎癥的具體物質，還有待于進一步發現和研究。