微流控芯片非接觸電導法快速測定鹽酸美金剛片中鹽酸美金剛的含量

李智磊，李靜嵐，陳纘光，王宇航，胡姍姍，楊秀娟*，王 勇*

(1.南方醫科大學珠江醫院 藥學部，廣東 廣州 510280；2.深圳市第二人民醫院 藥學部，廣東 深圳 518035；3.中山大學 藥學院，廣東 廣州 510006)

鹽酸美金剛是一種非競爭性、電壓依賴性的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體抑制劑，是臨床治療中至重度阿爾茨海默病的主要藥物，具有降低β-淀粉樣蛋白毒性，減少小膠質細胞相關炎癥，增加星形膠質細胞的神經營養因子釋放等作用[1]。鹽酸美金剛的含量測定對藥品質量控制、生物醫學研究等具有重要意義。

由于鹽酸美金剛具有溶解度小、無紫外吸收等特性，因而無法以常用的高效液相色譜-紫外檢測器檢測[2]。目前，文獻報道的鹽酸美金剛含量測定方法主要有高效液相色譜-示差折光檢測法[2]、柱前衍生高效液相色譜法[3]、氣相色譜法[4]、酸性染料比色法[5]、激光誘導熒光檢測法[6]等。但高效液相色譜-示差折光檢測法的分析成本較高，試劑消耗量較大；氣相色譜法的分析成本也較高，分析時間較長；酸性染料比色法需藥物與額外的酸性染料絡合；激光誘導熒光檢測法與柱前衍生高效液相色譜法均需化學衍生化處理。因此，目前亟需一種成本低、試劑消耗少、方法簡單、檢測快速的鹽酸美金剛檢測方法。

微流控芯片是將反應、分離、檢測等集成于微芯片上的一種新技術，具有分析速度快、樣品處理簡單、重復性好、成本低等優點[7]，已應用于藥物與細胞相互作用、食品安全分析、臨床檢測、藥物篩選等多種領域[8-11]。其中，微流控芯片非接觸電導法是微流控芯片技術主流的檢測方法之一，在藥物分析方面具有較多應用[12-16]，適用于需要快速化、便攜化、低成本測試的場景，但未見將該方法應用于鹽酸美金剛測定的文獻報道。根據藥品標準查詢數據庫[17]，包括2015版中國藥典、部頒化學藥品與制劑等多種質量標準數據庫，均無鹽酸美金剛相關的國家及地方的質量檢測標準。因此本研究采用微流控芯片非接觸電導法建立了快速測定鹽酸美金剛片中鹽酸美金剛含量的方法，以期為鹽酸美金剛的現場質量控制及質量檢測標準建立提供參考，同時也為鹽酸美金剛的醫藥學研究提供了一種新型的快速檢測方法。

圖1 微流控芯片及非接觸電導分析儀的結構圖

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

μD-CCD/HV-2014型微流控芯片非接觸電導分析儀，包括高壓電源、非接觸電導檢測器和色譜工作站(中山大學藥學院研制);聚 甲 基 丙 烯 酸 甲 酯(PMMA)十字通道芯片(大連理工大學微系統研究中心，微通道上寬30 μm，下寬100 μm，深30 μm);微流控芯片非接觸電導分析儀與芯片結構見圖1；SHZ-D(Ⅲ)型循環水式真空泵(鞏儀市英峪予華儀器廠)；ME4001型十萬分之一電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)。

鹽酸美金剛片(聯邦制藥股份有限公司，批號：81216202、90216201、90316262，規格：10 mg/片)；鹽酸美金剛對照品(北京索萊寶科技有限公司，批號：109A022，純度≥98%)；三乙胺(上海阿拉丁試劑有限公司)、磷酸(天津市大茂化學試劑廠)均為色譜純，其余試劑均為分析純；實驗用水為雙蒸水。

1.2 檢測條件

緩沖溶液：含有2%(體積分數)二甲基亞砜(DMSO)的3.0 mmol/L三乙胺-2.0 mmol/L磷酸緩沖溶液(pH 3.3)；進樣時間：10 s；分離電壓：2.0 kV；根據前期工作[18]，非接觸電導檢測器的激發電壓：60 V，激發頻率：60 kHz。實驗在恒溫(20 ℃)、恒濕(60%)條件下進行。

1.3 實驗方法

1.3.1 儀器使用方法首先，使芯片上所有儲液池和通道充滿緩沖溶液，吸除樣品池中的緩沖溶液，在樣品池中加入樣品溶液。然后，在進樣通道兩端加上進樣電壓，進行進樣；進樣完畢后，在分離通道兩端加上分離電壓，進行分離。樣品通過檢測器被檢測，得到待測樣品的檢測分離圖譜。

1.3.2 供試品溶液的制備取鹽酸美金剛片20片在研缽中研細，精密稱取2.104 0 g(約含鹽酸美金剛100 mg)，置于50 mL容量瓶中，加入緩沖溶液定容，超聲6 min后，得鹽酸美金剛質量濃度約為2 mg/mL的供試品貯備液，于4 ℃下保存備用，臨用前加入緩沖溶液稀釋至所需濃度。

1.3.3 對照品溶液的制備精密稱取鹽酸美金剛對照品0.020 0 g，置于10 mL容量瓶中，加入緩沖溶液溶解并定容，超聲6 min后，得鹽酸美金剛質量濃度為2 mg/mL的對照品貯備液，于4 ℃下保存備用，臨用前加入緩沖溶液稀釋至所需濃度。

2 結果與討論

2.1 DMSO體積分數的優化

由于鹽酸美金剛在水中溶解度差，根據相似相溶原理，加入助溶劑DMSO改變溶液極性可增加鹽酸美金剛的溶解度。實驗對DMSO的體積分數(0.5%、1%、1.5%、2%、3%)進行了優化。結果顯示，2%的DMSO溶液可以完全溶解2 mg/mL鹽酸美金剛。因此，選擇DMSO的體積分數為2%。

2.2 緩沖溶液種類的優化

考察了對照品溶液(200 μg/mL)在含有2% DMSO的硼酸-硼砂、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸-組氨酸(MES-His)、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸-三羥甲基氨基甲烷(MES-Tris)、Tris-磷酸、Tris-檸檬酸、Tris-硼酸、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、乙酸-乙酸鈉、檸檬酸-檸檬酸鈉、三乙胺-硼酸、三乙胺-磷酸等緩沖體系的出峰情況。結果顯示：在含2% DMSO的三乙胺-磷酸緩沖體系中鹽酸美金剛有峰響應，且基線平穩,噪音低，峰形較好，出峰時間最短。在其他體系中不出峰，一方面可能與緩沖體系背景電導率與樣品解離的電導率相差不大有關，另一方面可能由于緩沖體系的pH值不適于樣品解離出峰。因此，選擇含有2% DMSO的三乙胺-磷酸作為緩沖溶液。

2.3 緩沖溶液濃度的優化

考察了三乙胺-磷酸的濃度對鹽酸美金剛分離效果的影響，分別測試了含有2% DMSO的2.5 mmol/L三乙胺-2.5 mmol/L磷酸緩沖溶液、5.0 mmol/L三乙胺-5.0 mmol/L磷酸緩沖溶液、10.0 mmol/L三乙胺-10.0 mmol/L磷酸緩沖溶液、20.0 mmol/L三乙胺-20.0 mmol/L磷酸緩沖溶液。結果發現，隨著濃度的增大，基線噪音也隨之增大，且鹽酸美金剛出峰不明顯，因此最終選擇緩沖對離子總濃度為5.0 mmol/L。

2.4 緩沖溶液pH值的優化

考察了緩沖體系(均含2% DMSO)pH值對出峰的影響。如圖2所示，鹽酸美金剛在2.0 mmol/L三乙胺-3.0 mmol/L磷酸緩沖溶液(pH 2.9)中出峰情況較差，峰形為三峰；在2.5 mmol/L三乙胺-2.5 mmol/L磷酸緩沖溶液(pH 3.2)中的出峰情況稍有改善，但峰形為雙峰；在3.0 mmol/L三乙胺-2.0 mmol/L磷酸緩沖溶液(pH 3.3)中峰形良好，為單峰，且基線噪音較低；在4.0 mmol/L三乙胺-1.0 mmol/L磷酸緩沖溶液(pH 7.7)中的基線噪音低，但峰展寬，峰形較差。

上述結果表明，隨著pH值增加以及三乙胺濃度的增大，鹽酸美金剛的峰形由多峰變為單峰。但pH值過大、磷酸濃度過小會出現單峰峰展寬、出峰時間延后等現象，這可能與三乙胺-磷酸相對濃度改變導致緩沖溶液極性變化以及與緩沖溶液pH值有關。因此，最終選擇含2% DMSO的3.0 mmol/L三乙胺-2.0 mmol/L磷酸緩沖溶液(pH 3.3)作為運行緩沖體系。

2.5 進樣時間的優化

考察了進樣時間在5～20 s范圍內對樣品分離和檢測的影響。結果顯示，隨著進樣時間的延長，峰形及體系噪音等未發生明顯變化，而樣品由于進樣時間增加，進樣量增大，導致檢測峰信號的響應值增大，但隨著進樣時間的增加,峰展寬和峰形拖尾等影響變得顯著。綜合考慮，最終選擇進樣時間為10 s。

2.6 分離電壓的優化

考察了分離電壓在1.0～3.0 kV范圍內對樣品分離和檢測的影響。結果發現，較低的分離電壓會使樣品的出峰時間延長，且可能出現拖尾現象；而分離電壓過高時，電流增大，因焦耳熱效應，基線噪音也隨之增加，導致信噪比下降。綜合考慮峰形、響應值、噪音等因素，選擇最佳分離電壓為2.0 kV。

圖2 鹽酸美金剛在含2% DMSO的不同pH值的三乙胺-磷酸緩沖體系下的微流控芯片電泳色譜圖

2.7 方法學考察

2.7.1 線性關系、檢出限與定量下限按“1.3.3”方法配制質量濃度分別為10、50、100、200、400、600、800、1 000、2 000 μg/mL的系列對照品溶液，按“1.2”條件進行測定。以鹽酸美金剛的質量濃度(x，μg/mL)為橫坐標，峰高(y，mV)為縱坐標進行線性回歸，得鹽酸美金剛的線性范圍為10～2 000 μg/mL，回歸方程為y=0.596 4x+52.68(r2=0.999 1)。分別以3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)得到鹽酸美金剛的檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)分別為7 μg/mL和10 μg/mL。

2.7.2 精密度實驗取對照品貯備液適量，按“1.3.3”方法制備質量濃度為100 μg/mL的對照品溶液。取上述溶液，按“1.2”條件重復進樣測定6次，結果顯示鹽酸美金剛峰高的相對標準偏差(RSD，n=6)為1.3%，表明儀器精密度良好。

2.7.3 穩定性實驗取樣品(批號:81216202)適量，按“1.3.2”方法制備質量濃度為100 μg/mL的供試品溶液。分別于4 ℃下避光放置 0、2、4、8、12、24 h，按“1.2”條件進樣測定，結果顯示鹽酸美金剛峰高的RSD(n=6)為1.6%，表明供試品溶液在 4 ℃下放置 24 h內穩定性良好。

2.7.4 重復性實驗精密稱取同一批次樣品(批號:81216202)適量，共6份，精密稱定，按“1.3.2”方法制備質量濃度為100 μg/mL的供試品溶液。按“1.2”條件進樣測定，結果顯示鹽酸美金剛峰高的RSD(n=6)為1.8%，表明本方法重復性良好。

2.7.5 加標回收率實驗精密稱取樣品適量(批號:81216202)，共9份，分別置于10 mL容量瓶中，各加入低、中、高3個水平的對照品，按“1.3.2”方法制備供試品待測液，在“1.2”條件下進樣測定，記錄峰高并計算加標回收率，結果見表1。結果顯示，鹽酸美金剛的平均加標回收率為96.5%～99.2%，RSD為3.0%，表明該方法準確度良好。

表1 加標回收率實驗結果(n=9)

2.8 樣品測定

取供試品貯備液1 mL，置于20 mL容量瓶中定容(約含鹽酸美金剛100 μg/mL)，按“1.2”條件進樣測定，記錄電泳色譜圖與峰高，并計算鹽酸美金剛的質量濃度，結果見表2。結果顯示，3批次樣品測定的平均質量分數為99.46%～103.27%，RSD為0.60%～2.1%，表明該方法在不同批次樣品測定中的重復性良好。鹽酸美金剛片供試品溶液的電泳色譜圖見圖3,鹽酸美金剛的保留時間低于18 s。

表2 樣品的測定結果(n=6)

圖3 供試品的微流控芯片電泳色譜圖

3 結 論

本文建立了微流控芯片非接觸電導法快速測定鹽酸美金剛片中鹽酸美金剛含量的方法。所建方法的線性范圍寬，檢測速度快，藥品及試劑消耗量少，成本低，操作簡便，可在18 s內實現鹽酸美金剛片中鹽酸美金剛的快速測定，為鹽酸美金剛的現場質量控制及質量標準建立提供了參考。