元素含量分析應用于櫻桃產地溯源

盧 麗，劉 青，丁 博，李志勇*，李波平，關麗軍，謝湘娜

(1.廣州海關 廣東省動植物與食品進出口技術措施研究重點實驗室,廣東 廣州 510623;2.廣州醫科大學 藥學院，廣東 廣州 511436)

櫻桃酸甜可口、營養豐富，備受國人青睞。它們在廣東及香港地區被直譯為“車厘子”，即英語單詞“Cherry”(櫻桃)的音譯，但并非指中國櫻桃，而指產于美國、加拿大、智利等美洲國家的個大、皮厚的進口櫻桃。櫻桃色澤鮮艷、晶瑩美麗，加之果實富含糖、蛋白質、維生素及鈣、鐵、磷、鉀等多種元素，使其成為一種價值較高的特色進口水果之一。2014年中國已成為櫻桃進口量第三大國，櫻桃進口額世界第一[1]。

中國目前也有車厘子果樹的引種，山東、大連的部分品種櫻桃在外觀上與進口車厘子基本一樣，難以肉眼區分。不法商家為獲得更大的市場利益，以次充好以及假冒產地的情況時有發生，嚴重影響了行業的健康發展及消費者利益。因此，高價值特色農產品原產地鑒別技術的研究越來越多引起研究者的關注。

近年來，利用現代分析技術對農產品進行產地鑒別有較多報道[2-4]。礦物元素指紋圖譜技術可通過分析不同來源生物體中礦物元素的組成和含量，再利用方差分析、聚類分析和判別分析等數理統計方法篩選出有效指標，進而建立判別模型和數據庫，實現農產品的溯源和確證[3]。目前，用于產地溯源的礦物元素分析方法有電感耦合等離子體質譜法(Inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)和電感耦合等離子體發射光譜法(Inductively coupled plasma-optical emission spectroscopy,ICP-OES)[5-21]。本文利用ICP-MS和ICP-OES測定櫻桃中51種元素含量，并基于化學計量學中主成分分析(Principal component analysis,PCA)和偏最小二乘法-判別分析(Partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)法建立了美國、加拿大、中國3個產地櫻桃的判別模型。該技術的建立可為規范中國櫻桃消費市場，提高相關部門的反欺詐監管水平，維護消費者權益，具有良好的社會和經濟效益。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

92份櫻桃樣品分別來自美國(50個)、中國(31個)和加拿大(11個)。其中11個加拿大及20個美國樣品為廣州機場口岸進口，其余為廣州大型超市、百果園水果超市或淘寶原產地購買而得。

濃硝酸(UP級，質量分數68%，蘇州晶瑞公司)；實驗用水為超純水(電阻率>18.2 MΩ·cm,20 ℃)；43種ICP-MS多元素標準溶液IV-ICP-MS-71A(10 μg/mL,iNORGANic Ventures)；多元素標準溶液IV-CCS-5(100 mg/L,iNORGANic Ventures)；16種元素ICP-MS混標(100 mg/L,O2si)；定制3種元素ICP-MS稀土內標混標Re、Rh、In(100 μg/mL)均購自上海安譜實驗科技股份有限公司。鋰(100 μg/mL，中國計量科學研究院)；鈉、鎂、磷、鉀、鈣(1 000 μg/mL，中國計量科學研究院)；生物成分分析標準物質GBW10021(GSB-12豆角)和GBW10020(GSB-11柑橘葉)均購于國家標準物質網。含有Ba、Be、Ce、Co、Li、Mg、Rh、U的調諧液(10 μg/mL)購于美國珀金埃爾默儀器公司。

1.2 儀器與設備

Pro Blends 5勻漿機(飛利浦)；MS 303TS/02型電子天平(美國梅特勒-托利多公司)；Milstone超級微波消解儀(意大利Milestone公司)；Milli-Q超純水系統(Millipore公司)；Perkinelmer SPB·50-48石墨消解儀、PE ELAN-DRC-e電感耦合等離子體質譜儀、PE 5300電感耦合等離子體發射光譜儀(美國PE公司)。實驗所用消化管為石英材質，盡量不使用玻璃材質器具。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品采集2018年5月～8月，收集廣州機場口岸進口的美國和加拿大產區櫻桃樣品，同時在廣州永旺、百佳、CASMIA TASTE等大型超市或淘寶原產地，以約每周一次的頻率購買美國或國產櫻桃樣品。

將收集到的櫻桃樣品先用去離子水洗凈，瀝干水分，去核，將果肉放入勻漿機攪拌成勻漿，待測。

1.3.2 樣本消解及元素含量測定參考GB 5009.268-2016食品中多元素檢測方法[22]，準確稱取1.0 g櫻桃勻漿樣品于石英消化管中，加入3 mL濃硝酸，放入超級微波消解儀中，采用程序升溫法進行超級微波消解，待消解完成后，再放入石墨消解儀以130 ℃加熱趕酸約2 h，最后用去離子水轉移樣品，定容至25 mL。采用同樣方法制備試劑空白和質控樣品。

1.3.3 數據處理用SIMCA軟件對數據進行主成分分析(PCA)和線性判別分析(PLS-DA)，比較不同產地櫻桃中礦物元素的差異顯著性，建立櫻桃產地判別模型，鑒別櫻桃產地來源并驗證產地判別效果。

2 結果與討論

采用ICP-MS和ICP-OES測定櫻桃樣品中Be、B、Na、Mg、Al、Si、P、K、Ca、Sc、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、Ge、As、Se、Sr、Y、Zr、Nb、Mo、Ag、Cd、Sn、Sb、Cs、Ba、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Pb、Th、U、Tl共51種礦物元素的含量。其中，Na、Mg、P、K、Ca用ICP-OES檢測，其它元素用ICP-MS檢測，均采用外標法定量。ICP-MS用內標元素Rh和In保證儀器的穩定性，每個樣品重復測定3次。用生物成分標準物質GBW10021(GSB-12豆角)和GBW10020(GSB-11柑橘葉)作為質控樣，對質控樣中沒有參考值的元素Ga、Zr和Nb以及特殊元素Al和Si進行6次平行測定的加標回收試驗，作為測試方法準確性的判定依據。

2.1 方法準確度及精密度

GBW10021(GSB-12豆角)和 GBW10020(GSB-11柑橘葉)測試結果見表1。由表1可見，除了鋁和硅2種元素檢測值低于證書給定值外，其他各待測元素的測定值與標準證書值相吻合，相對標準偏差(RSD)均不大于10.33%。硅和鋁因其存在形式和元素本身的性質，在只用硝酸不加氫氟酸的微波消解條件下難以全部以游離態離子溶出，故只檢出酸可溶性硅和鋁的含量。采用加標回收的方法驗證Al和Si以及生物成分標準物質缺少的Ga、Zr、Nb。這5種元素6次平行測試的加標回收率為90.6%～99.4%，RSD為2.5%～9.0%。從質控樣及加標回收檢測結果可知，該方法測定櫻桃樣品中51種元素具有良好的準確性和精密度。

表1 生物成分標準物質證書值及檢測結果(n=3)

(續表1)

Elements(10-6)GBW10021(GSB-12 beans)certificate valueMeasured valueRSD/%GBW10020(GSB-11 citrus leaves)certificate valueMeasured valueRSD/%Si?(0.27)0.049 59.470.41±0.080.045 013.8Sm??29±428.96.4380±7752.18Sn(0.2)0.1879.083.8±0.53.821.08Sr55±352.42.50170±101750.76Tb??4.1±0.53.641.9411±19.610.75Th0.055±0.0100.059 47.230.14±0.020.1281.45Ti21±419.60.5138±1028.30.89Tl??4.2±0.83.481.1460±8560.26Tm??1.8±0.31.545.533.8±0.92.970.78U??90±585.52.1845±1038.71.02V0.51±0.060.5104.001.16±0.131.102.16Y0.155±0.0170.1493.420.42±0.040.4003.23Yb??11±29.165.3825±523.01.67Zn32±231.79.1118±216.10.11

*indicate the unit is 10-2，**indicate the unit is 10-9

2.2 不同產地櫻桃溯源模型的建立

2.2.1 不同國家櫻桃樣品的分布情況農產品產地溯源鑒定研究中，樣品的來源真實性問題決定產地溯源鑒定模型的準確性，其評估方法主要有地理標簽標記和樣品成分分析兩種方法，本文采用樣品成分分析法評估櫻桃樣品來源的真實性。研究選擇植物生長過程中必需的大量元素Mg和Ca以及微量元素Mn、Fe和Zn為代表元素，依據櫻桃樣品中此5種元素含量來評估美國、加拿大和中國產地來源的樣品代表性問題，根據實驗數據的統計分布描述方法之一的QQ圖，判斷3個產地來源樣品是否符合正態分布，以評估櫻桃樣品的來源真實性問題。基于31個中國樣品、50個美國樣品和11個加拿大樣品中Mg、Ca、Mn、Fe和Zn元素含量，發現3個國家樣品中礦物質含量數據呈正態分布，以植物大量必需元素Ca和微量必需元素Fe的QQ圖進行解釋(圖1)。由圖可知，中國、美國和加拿大三地區來源的櫻桃樣品中必需元素的含量數據呈線性關系，該規律表明3個國家來源的櫻桃樣品呈正態分布趨勢，由此推測從國內海關口岸、市場及櫻桃生產基地購買的樣品具有一定代表性，樣品的來源真實性比較可靠，可用于產地溯源模型的鑒定研究。

圖1 不同國家櫻桃樣品中典型代表大量必需元素Ca與微量必需元素Fe含量的QQ圖分布

2.2.2 不同產區樣品礦物元素含量分析對中國、美國和加拿大來源的櫻桃樣品進行ICP-OES和ICP-MS分析，51種礦物質元素含量見表3。櫻桃樣品中大量必需元素Mg、Si、P、K和Ca，以及微量必需元素B、Na、Fe、Mn、Cu、Zn的含量均在1 mg/kg以上，而Mo和Ni兩種微量必需元素含量比較低，尤其是Mo元素，除了加拿大櫻桃的Mo含量在22 μg/kg左右外，其余兩產地櫻桃中Mo含量均低于10 μg/kg。櫻桃樣品中非必需元素中除Al外，其余非必需元素含量均較低。進一步研究發現，不同地區櫻桃樣品中單一必需元素含量在相同的數量級范圍內，因此單一元素含量信息無法判別樣品的產地來源，需開展多元素含量分析，構建櫻桃樣品的產地溯源鑒定模型。

表3 不同地區櫻桃樣品中礦物元素含量

*indicate the unit is mg/kg;-:no detected

圖2 PCA 判別模型

2.2.3 PCA主成分分析由表3可見，同一元素在不同國家間以及同一地區不同批次間樣品標準偏差較大，表明選擇此51種元素作為研究對象時，單一元素因素組內和組間差異顯著，不能通過某1個或幾個元素進行產地來源的鑒定，需根據櫻桃中51種元素含量分布情況，進行多元統計分析來鑒別櫻桃產地。將不同產地櫻桃中51種元素含量數據進行主成分分析(PCA)，結果見圖2。由圖可見，除2個美國櫻桃和2個加拿大櫻桃樣品離群外，中國與美國、加拿大兩國產地來源的櫻桃具有不同的聚集效應，因美國與加拿大地域相近，其櫻桃樣品分布區域相同，而中國與兩者的地理位置相距甚遠，使得櫻桃樣品分布區域顯著不同。由此可通過櫻桃中金屬元素含量分布情況，進行櫻桃產地來源判別。另外，4個中國產地櫻桃樣品分布到美國加拿大區域，推測可能是產地信息標記錯誤。

圖3 PLS-DA 判別模型

圖4 PLS-DA 模型的元素VIP值分布情況

圖5 優化后PLS-DA產地溯源鑒定模型

2.2.4 PLS-DA判別分析為進一步優化櫻桃產地溯源的判別模型，將93個櫻桃樣品的51種元素含量進行偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)，構建不同產地櫻桃的PLS-DA鑒定模型(圖3)。由圖可知，與PCA鑒定模型相似，PLS-DA模型中不同國家產地來源櫻桃樣品也具有一定聚類效應；其中美國和加拿大櫻桃樣品有一定區分，但無法顯著區分；而中國櫻桃可顯著區分美國、加拿大兩國。與PCA模型一樣，也有4個中國櫻桃樣品分布到美國加拿大區域之內，推測可能是樣品來源信息標記錯誤導致。

51種元素含量信息顯示PLS-DA模型變量參數比較多，需優化減少模型的變量參數。本研究通過變量對模型的重要性指標(VIP)來優化模型的變量數目，以減少金屬元素變量(圖4)。由圖4可知，以VIP>1的元素為顯著變量，確定PLS-DA模型的顯著變量元素有Pr、Nd、Ce、Y、Co、Mo、Mn、Dy、Gd、Ni、Ho、Sm、Sr、Er、Ga、U、Na、Yb、Be和Zn。其中Mo、Mn、Zn是植物必需營養元素，Co和Na是植物可能必需營養元素,Pr、Nd、Ce、Y、Dy、Gd、Ho、Sm、Er、Yb為稀土元素,Be和Sr為堿金屬元素。由此可知，在16個植物必需元素中，櫻桃對其中的Mo、Mn、Zn 3個必需營養元素吸收差異顯著，對鈉和鈷2個可能必需營養元素吸收差異顯著；此外，櫻桃對10個稀土元素的吸收差異也比較顯著。以此20個顯著元素變量構成的PLS-DA鑒定模型分析結果見圖5。

由圖3和圖5可知，PLS-DA產地溯源鑒定模型中元素變量參數優化前后，產地溯源鑒定模型結果基本一致，由此推測此20種元素變量為主要貢獻率成分，在后續櫻桃樣品PLS-DA產地溯源模型構建過程中，僅需檢測分析此20種元素的含量信息，即可構建櫻桃樣品產地溯源鑒定模型。

2.2.5 不同產地櫻桃產地溯源模型中主成分貢獻率元素以PLS-DA模型分析所得20種顯著性的元素含量數據進行PCA分析(圖6)。研究表明，PCA產地溯源鑒定模型與PLS-DA結果一致，說明挑選出的20種顯著性元素含量信息均可應用于兩種模型鑒定中國與美國、加拿大兩地的櫻桃樣品。由圖6B可見，美國和加拿大2個產地櫻桃樣品的溯源鑒定模型中主成分貢獻率元素為Mo、Ga、Sr和U；而中國產地櫻桃樣品的溯源鑒定模型中主成分貢獻元素為Pr、Nd、Ce、Y、Co、Mn、Dy、Gd、Ni、Ho、Sm、Er、Na、Yb、Be和Zn，其中又以稀土元素為主，這可能與櫻桃樣品來源有關，中國櫻桃樣品主要來源于稀土元素礦產資源主要分布地區之一的山東省，導致山東櫻桃樣品中稀土元素含量較高，與美國、加拿大兩國櫻桃樣品相比，中國櫻桃中稀土元素含量比較顯著。

圖6 優化后櫻桃樣品的PCA產地溯源鑒定模型的分析結果

優化后櫻桃產地溯源鑒定PCA模型中20種元素的第一主成分和第二主成分的方差貢獻率如下：

t[1]=0.184Be+0.075Na+0.230Mn+0.256Co+0.234Ni+0.152Zn-0.126Ga-0.149Sr+0.284Y-0.112Mo+0.298Ce+0.298Pr+0.292Nd+0.248Sm+0.263Gd+0.279Dy+0.247Ho+0.241Er+0.183Yb-0.090U;

t[2]=-0.012Be+0.024Na-0.282Mn-0.173Co-0.240Ni-0.177Zn-0.552Ga-0.218Sr-0.112Y-0.040Mo-0.048Ce-0.095Pr-0.105Nd+0.107Sm+0.102Gd-0.018Dy+0.057Ho+0.188Er+0.360Yb+0.249U。

圖7 優化后櫻桃樣品的PCA產地溯源鑒定模型的三維示意圖

采用優化后PCA鑒定模型的第一主成分和第二主成分以及中國、美國和加拿大櫻桃構成三維PCA模型(圖7)，結果顯示，3個產區三維圖與二維圖一樣，均可顯示出中國產地櫻桃顯著不同于美國和加拿大。

2.3 產地溯源PLS-DA模型對未知產地櫻桃樣品的識別率

選擇2018年和2019年收集的20個櫻桃樣品作為鑒別模型的盲樣驗證樣品，分別是6個加拿大樣品(1個2019年樣品)、8個美國樣品(3個2019年樣品)和6個中國樣品(2個2019年樣品)，利用構建的2018年櫻桃樣品PLS-DA產地溯源鑒定模型預測判斷20個樣品的產地來源。結果顯示，該模型可正確鑒定5個加拿大產地樣品，4個美國樣品和5個中國樣品；對加拿大、美國、中國3個產地樣品識別率分別為83.3%、50%、83.3%。進一步分析發現，PLS-DA產地溯源鑒定模型對2019年收集來源的1個加拿大樣品、3個美國樣品和1個中國樣品，預測識別錯誤；由此可知，櫻桃的產地溯源模型識別率還與樣品的年份密切相關。

3 結 論

采用ICP-MS和ICP-OES多元素分析技術，對美國、加拿大、中國3個產地92個櫻桃中的51種元素進行了測定，根據試驗數據的統計分布描述方法之一的QQ圖，判斷三產地來源的樣品符合正態分布，確立櫻桃樣品的來源真實可靠，并進行PCA和PLS-DA分析，成功建立了判別模型，并通過PLS-DA模型的VIP值優化櫻桃樣品中元素變量數目，將模型變量降至20種元素；發現中國產地來源的櫻桃樣品中稀土元素含量顯著高于美國、加拿大。該方法基本可滿足對美國、加拿大和中國產區櫻桃的產地溯源要求。