不同植茶年限茶樹根際土壤細菌多樣性及群落結構研究

許廣 王夢姣，2 鄧百萬，2 郭苗苗

（1. 陜西理工大學生物科學與工程學院，漢中 723000；2. 陜西省食藥用菌工程技術研究中心，漢中 723000）

在植物根際土壤中，土壤-微生物-植物根際之間相互影響，相互作用［1］。根際微生物在土壤的物質轉化［2］、促進植物吸收養分［3］、提高植物抗病蟲害能力［4］、提高植物抗逆性［5］、生長發育等方面發揮著極其重要的作用，同時根際土壤微生物種類和數量也是評價土壤肥力高低的重要生物指標。

根際土壤細菌代謝旺盛，繁殖速度快，是植物根際土壤微生物數量、種類較多的類群［6］，幾乎驅動所有生物地球化學循環，參與土壤中養分轉化［7］。例如：熒光假單孢菌（Fluorescent pseudomonas）［8］作為生防菌抑制病原真菌生長、固氮細菌（Azotobacter）［9］能促進對氮元素的吸收，伯克霍德氏菌（Burkholderia）［10］能溶解硅酸鹽礦物，減少環境污染等等。

近年來在植物土壤微生物多樣性方面研究很多，但是主要集中在農作物［11-14］、林木［15］等方面，對茶樹根際土壤微生物的研究較少。本文選取漢中西鄉地區3種植茶年限的茶樹，采用傳統培養法和高通量測序技術研究其根際土壤細菌多樣性和群落結構組成，并分析茶樹土壤理化性質與細菌群落的相關性，為改善茶樹的土壤和提高茶樹產量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

采樣地位于秦巴山區腹地的漢中市西鄉縣千山茶園，屬北亞熱帶半濕潤季風氣候，土壤類型為礦物質含量較高的黃棕壤，茶樹其他自然生長條件見表1。自20世紀90年代以來，該地已經建立茶葉生產基地，當前已經形成規模廣大、管理良好的現代化生態茶園。施肥上采用機械化方式施加有機肥，同時補充氮肥，葉面肥。基于生態和綠色有機理念，茶樹種植方面均采用有機肥，實現精準施肥，減少人為干預。

研究對象選取該茶園種植年限為5年（32°56'2″ N，107°51' 32″ E，737 m）、10 年（32°56'14″N，107°51' 59″ E，805 m）、20 年（32°56' 58″ N，107°52' 13″ E，814 m）且品種均為紫陽群體的茶樹根際土壤。

采樣時間為2018年9月，天氣晴朗，用五點采樣法收集距茶樹主干20 cm，垂直深度20-40 cm的根際土壤。用抖落法去掉與根系結合松軟土壤，將剩余土壤與根系裝入無菌密封塑料袋中，貼上標簽，立即帶回實驗室混勻，過2 mm篩，一部分用于分子實驗并保存于-80℃冰箱，一部分用于測定土壤理化性質。

表1 茶樹生長環境基本情況

1.2 方法

1.2.1 傳統培養法分析不同植茶年限茶樹根際土壤細菌多樣性

1.2.1.1 根際細菌的分離計數及純培養 稱取10 g茶樹土壤依次制備成10-1、10-2、10-3梯度稀釋液。各吸取100 mL至牛肉膏蛋白胨培養基上，涂布均勻，37℃培養14-18 h，重復3次，利用菌落計數器計數。

1.2.1.2 根際細菌16S rDNA的擴增及鑒定 用天根細菌試劑盒提取基因組DNA，用通用引物E-27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-G GTTACCTTGTTACGACTT-3'）進行16S rDNA的序列擴增。送天津擎科生物公司測序。將所測的序列提交到GenBank數據庫中并進行BLAST檢索，下載同源性較高的數據，初步確定分離得到菌的種屬。

1.2.1.3 根際細菌的種群多樣性分析 計算不同植茶年限茶樹根際土壤細菌的香儂-威納指數（Shannon-Wiener）、辛普森指數（Simpsonindex）、豐富度指數（Margalef index）、均勻度（Evenness），具體分析方法參考文獻［16-17］。

1.2.2 高通量測序分析不同植茶年限茶樹根際土壤細菌多樣性

1.2.2.1 DNA提取、16S rDNA擴增和高通量測序用Power SoilDNA Isolation Kit試劑盒提取土壤微生物總DNA，用Nano Drop分光光度計（Nano-100，Aosheng Instrument Co Ltd.）檢測DNA的濃度和純度。用 引 物 515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）擴增細菌16S rDNA序列的V3-V5區。PCR反應體系為50 μL，2×Premix Taq 25 μL，515F/806R 引物各 1 μL，DNA 3 μL，Nuclease-free water 20 μL， 反 應 條 件 ：94℃ 5 min，30個循環（94℃，30 s；52℃，30 s；72℃，30 s），72℃ 10 min，4℃ 保存。使用 Illumina Hiseq2500平臺進行測序。

1.2.2.2 高通量測序數據處理 利用Trimmomatic軟件得到質控后的PE reads。選擇FLASH軟件將其拼接為原始序列。然后利用Mothur軟件將序列分配至相應的樣品中，得到最終片段。利用Usearch［18］軟件以97%的相似度將Tags聚類成為OTU，并計算Chao1指數、Shannon指數、Simpson指數、均一度，具體方法參考［19］。同時基于MRPP多相應置換過程分析、Adonis置換多因素方差分析、Amova分子方差分析進行差異檢驗，從而獲取樣品多樣性和組間顯著性差異分析，具體方法參考［20］。

1.2.3 土壤理化性質的測定 土壤有機碳（TOC）測定采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法，總氮（TN）測定采用凱氏定氮法，水解性氮（HN）測定采用堿解擴散法。總磷（TP）測定采用堿熔法，有效磷（AP）測定采用電感耦合等離子體發射光譜法，全鉀（TK）測定采用堿熔法，速效鉀（AK）測定采用1 mol乙酸銨浸提法，pH計測定土壤pH，具體方法參考［21-22］。

2 結果

2.1 培養法結果分析

2.1.1 不同植茶年限茶樹根際土壤的細菌數 不同年限茶樹土壤細菌數目存在顯著性差異。5年茶樹的根際土壤細菌數量明顯高于10年和20年，細菌數目隨著植茶年限之間增加呈現下降趨勢（圖1）。

圖1 不同植茶年限的茶樹細菌菌落數

2.1.2 不同植茶年限茶樹根際土壤的細菌組成 對3種不同種植年限的茶樹根際土壤進行16S rDNA測序和比對分析。結果表明，在門水平上，3種年限之間群落組成有較大差異，10年的茶樹土壤細菌門種類最多（圖2-A），厚壁菌門（Firmicutes）為優勢菌門，在5年、10年、20年茶樹土壤中所占比例均最大，分別為93.7%、77.5%、87.5%，；在屬水平上，芽孢桿菌屬（Bacillus）在3種年限中均為優勢菌屬，比例分別是62.5%、75.5%、79.4%，不同年限之間細菌構成和多樣性有顯著性差異，10年的茶樹土壤細菌多樣性最為豐富，5年生次之，20年生最低（圖 2-B）。

圖2 不同植茶年限下的茶樹根際細菌組成

2.1.3 不同植茶年限茶樹根際細菌的多樣性比較 利用牛肉膏蛋白胨培養基對3種年限茶樹根際土壤樣品進行分離純化，共獲得129株根際細菌，比較不同植茶年限的細菌多樣性。由表2可見，不同年限茶樹根際細菌群落的豐富度指數、Simpson指數、Shannon指數，存在顯著差異（P＜0.05），5年、10年、20年茶樹細菌豐富度指數分別為1.54、2.31、0.58，說明10年茶樹細菌豐富度最高，5年次之，20年最低。Simpson指數分別是0.54、0.42、0.27；Shannon指數分別為1.56、1.54、0.77。5年和10年茶樹細菌Simpson指數和Shannon指數相似且均明顯高于20年茶樹，說明5年和10年茶樹細菌的多樣性更為豐富，20年茶樹土壤細菌多樣性最低。

表2 不同種植年限茶樹根際細菌的多樣性指數比較

2.2 高通量測序結果分析

2.2.1 不同植茶年限茶樹細菌多樣性和群落結構差異性 利用高通量測序技術測得序列片段，使用QIIME軟件，基于97%的相似度將其聚類為OTU，共得到10 982條OTU。所有樣本Observed稀釋曲線趨于平緩，表明所測序列數據可以較好地反映細菌群落的種類與數量，基本涵蓋了樣本土壤的所有細菌種群，足以進行下游數據分析（圖3-A）。

通過Chaol指數、Simpson指數和Shannon指數來比較3種植茶年限下的土壤細菌豐富度和多樣性。根據Chaol指數得出，5年生的茶樹根際細菌物種總數最多，10年茶樹次之，20年最少（表3）；根據Simpson指數和Shannon指數得出，3種年限的茶樹細菌均表現出高水平的物種豐富度和細菌多樣性，同時不同年限之間存在顯著性差異；10年生的茶樹細菌Simpson指數和Shannon指數均最高，說明10年生的茶樹豐富度和多樣性均最高；20年生的茶樹根際細菌豐富度和細菌多樣性最低（圖3-BC）。對相對豐度較高（＞1%）的30個細菌菌群，在屬水平上進行聚類熱圖分析（圖3-D）。結果表明，5年和20年茶樹細菌群落結構和組成較為相似，與10年茶樹存在顯著性差異。基于MRPP、Anosim 和Adonis 算法的差異檢驗結果（表4）也表明3種植茶年限的土壤細菌群落結構存在顯著差異。

2.2.2 不同植茶年限茶樹土壤細菌群落組成差異性 3種年限的主要菌門（＞1%）共有16個（圖4-A），分別是奇古菌門（Thaumarchaeota）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、裝甲菌門（Armatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、衣 原 體（Chlamydiae）、 綠 菌 門（Chloroflexi）、Dependentiae、厚壁菌門（Firmicutes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、Latescibacteria、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、變形菌門（Proteobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、Patescibacteria。主要菌屬（＞1%）共有17個（圖4-B），分別是ADurb.Bin063-1、酸桿菌屬（Acidibacter）、根 瘤 菌 屬（Bradyrhizobium）、Bryobacter、 伯 克氏 菌 屬（Burkholderia）、Candidatus_Solibacter、Candidatus_Udaeobacter、戴爾福特菌屬（Delftia）、Dysgonomonas、 芽 單 胞 菌（Gemmatimonas）、Granulicella、HSB_OF53-F07、Massilia、Mucilaginibacter、地桿菌屬（Pedobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas）。

表3 不同種植年限的茶樹細菌多樣性比較

3種年限的茶樹土壤樣本各自特有OTU在各自總OTU數量中所占比例不同，分別為占5年茶樹（4 353）OTU數目的35.7%、占10年茶樹（3 782）OTU數目的26.0%、20年茶樹（2 847）OTU數目的20.3%。3種年限茶樹土壤公有OTU數為1 646個，分別占5年的37.8%、10年的43.5%、20年的57.8%（圖5）。該結果表明3種年限下的茶樹細菌群落組成存在顯著性差異。

2.2.3 不同植茶年限細菌群落結構對土壤理化性質的相關性 土壤理化性質結果見表5，其中TOC、TN、TK、AP、AK和pH在3種年限茶樹土壤中呈現顯著性差異。10年茶樹土壤TOC含量最高，5年和20年茶樹TOC差異不明顯，但都低于10年茶樹；三者的TN含量差異性顯著，10年最高，5年次之，20年最低；5年和20年茶樹土壤之間TK含量差異不明顯且低于10年茶樹土壤；5年茶樹土壤的AP含量顯著高于10年和20年茶樹；AK在10年和20年茶樹土壤中含量幾乎一致且明顯高于5年茶樹土壤；20年茶樹土壤pH明顯高于5年和10年；基于茶樹細菌群落結構與土壤理化因子間CCA數據和相關性熱圖（圖6）分析：TN、TK、AP、pH對漢中茶樹細菌群落的影響較大。

圖3 不同植茶年限茶樹細菌豐富度及多樣性分析

3 討論

土壤是茶樹生長的載體，茶樹連續種植后，極易導致土壤酸化［23］。本實驗結果表明植茶年限的增加，根際土壤pH呈現下降趨勢，與5年茶樹相比，20年茶樹根際土壤pH下降了18.5%，可見茶樹連續種植會引起土壤酸化，與前人研究結果一致。土壤中細菌種類最多，數量最大。細菌喜中性偏堿的土壤環境，連作會導致細菌數量的減少［24］，土壤貧瘠，自毒效應增強，多樣性降低，病蟲害加劇［25-26］。本實驗中兩種方法結果均表明隨著植茶年限的增加，茶樹根際細菌的數量呈現下降趨勢，多樣性也嚴重降低，與前人研究結果一致。

表4 不同植茶年限茶樹土壤細菌群落結構差異性分析

圖4 不同植茶年限根際細菌群落主要菌群相對豐度

圖5 不同年限茶樹土壤樣品OTU分布的Venn分析圖

表5 不同植茶年限和高產茶園土壤理化性質及CCA數據分析

比較傳統培養法和現代高通量測序技術的結果可見，后者得到的微生物多樣性遠遠高于前者。反映出土壤中存在許多不可培養的微生物［27］。兩種方法均表明植茶年限對細菌群落構成有顯著性影響，但是兩種方法獲得的優勢菌群有顯著差異，原因在于培養法分離細菌時僅采用牛肉膏蛋白胨培養基，其所含營養與土壤原始營養環境差異較大，使得對營養要求復雜、培養基偏好性、生長緩慢、貧營養型的微生物無法生長，僅利于某幾種微生物類群生長，使其成為平板上的優勢類群［28］。其次，微生物培養再選擇過程中部分微生物的信號會放大，其他大量微生物信息可能缺失［29］。例如：黃祖新等［30］采用培養法與非培養法比較宿根甘蔗根際土壤細菌多樣性時，得到Burkholderia和Acidobacteria分別是培養法和非培養法中的優勢菌群；崔中利［31］采用培養法與非培養法比較高產水稻土細菌多樣性時，得出培養法優勢菌為Pseudomonas和Bacillus與非培養法以Acidobacteria為主不同；楊虎［32］利用培養和非培養法分析冷藏雞肉胴體中的細菌多樣性，也得到完全不一致的結果。本文培養法結果表明Firmicutes和Bacillus在3種植茶年限中均為優勢門屬，原因在于芽孢桿菌具有外層芽孢，能耐高溫，耐酸，在實驗中易被分離到，形成平板優勢菌群。高通量測序結果顯示Acidobacteria、Proteobacteria、Bacteroidetes在3種植茶年限中均屬于優勢菌群，與Janssen［33］研究結果較為一致。Candidatus_Udaeobacter隨著植茶年限增加而比例逐漸變大且優勢愈發明顯，原因在于植茶年限增加會引起土壤微生態失調，單一化群落結構明顯，更利于某種菌的生長［34］。

圖6 茶樹根際細菌群落與理化因子的相關性熱圖分析

土壤微生物群落與土壤肥力之間有密切關系，養分含量嚴重影響土壤微生物數量和多樣性［35］。據報道，增加有效磷（AP）可以提高微生物多樣性［36］；pH值是影響土壤微生物群落結構的最強因素［37-38］，改善土壤pH對土壤微生物量和細菌群落多樣性具有積極意義［39］；全鉀（TK）與茶園生產力、細菌多樣性密切相關［40］；土壤中總氮（TN）可以影響微生物生物量［41］。本研究結果表明隨著植茶年限的增加，TN、TK、AP、pH均呈現出下降趨勢，從而導致細菌群落的數量和多樣性也隨之降低。同時結合高產茶園土壤主要養分指標分析，隨著植茶年限的增加，有必要采取措施防止土壤酸化，同時增施氮肥和磷肥，以提高茶園產量和品質。

本實驗培養法采用的培養基較單一，具有局限性，所獲得的細菌數量和種類均較少，但其優勢在于成本低、獲取的菌體純度高，是分離目標物種的重要手段，同時也保存了微生物菌種資源，用于實際生活生產方面。例如：通過培養法獲得的Viridibacillus arenosi可降解霉變玉米粉中的黃曲霉毒素B-1［42］；耐高溫的α淀粉酶也是由培養法獲得的芽孢桿菌產生［43］。高通量測序技術與培養法相比能更全面地反映不同植茶年限下茶樹根際細菌的物種組成及豐度信息。但是高通量測序技術獲取的信息量巨大，其歸類整合沒有嚴格標準，而且高通量測序技術僅以微生物DNA為檢測基礎，故無法區分死菌與活菌。綜上所述，我們在實際過程中，需要將這兩種方法相結合，以求獲取全面準確的信息，為改善茶樹的土壤和提高茶樹產量、后期研制微生物菌肥提高實驗數據。此外，本實驗僅對細菌群落進行了分析，對于茶園土壤其他種類的微生物類群，如真菌、放線菌等分布狀況，有待于進一步研究。

4 結論

不同植茶年限下的漢中茶樹根際土壤細菌多樣性豐富。在細菌群落構成方面，傳統培養法：厚壁菌門和芽孢桿菌屬在植茶年限為5年、10年、20年中均為優勢門屬；高通量測序技術：酸桿菌門、變形菌門、擬桿菌門和Candidatus_Udaeobacter在3種植茶年限中為優勢門屬。植茶年限增加會使茶園土壤呈酸化趨勢，且逐漸低于優質高產茶園土壤的最低標準。總氮、總鉀、總磷、pH是影響漢中茶樹細菌群落的關鍵理化因子；隨著植茶年限增加，要采取必要措施防止土壤酸化，適當增施氮肥和磷肥。