白僵菌在油茶苗圃地的宿存變化、介質影響及毒力分析

郭宗芳 謝再成

摘 ? ?要：研究白僵菌在土壤中的宿存變化和宿存菌株致病性，結果表明，在4～10月白僵菌成菌落數呈下降狀態，之后呈波動狀態。最終在土壤中的成菌落數維持在103CFU/土樣水平。處理濃度過大不利于白僵菌的長期宿存。白僵菌的宿存與混合介質有關。白僵菌在宿存過程中其宿存菌株的毒力穩定性有利于對害蟲的持續控制。

關鍵詞：球孢白僵菌;宿存變化;介質;毒力分析;油茶苗圃

球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是一種昆蟲病原真菌，廣泛應用于林業害蟲的防治[1]。同時在地下害蟲防治上也能達到很好的防治效果。白僵菌不但能寄生昆蟲，而且能在生態系統中寄主昆蟲缺乏的時候，在不同的環境中營腐生生活[2-3]。 因此，研究白僵菌在土壤中的宿存情況、使用中的不同混配介質對白僵菌宿存影響比較，為白僵菌菌肥制劑的開發應用提供一些幫助。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 試驗地點

贛州市林科所油茶苗圃，試驗區地勢平整，土壤偏酸性，肥水管理一致。

1.2 ? 材料

菌株來源：贛州市林科所儲存的馬尾松毛蟲菌株;家蠶僵蟲分離菌株;PDA培養基分離純化培養。

白僵菌孢子粉來源：贛州市林業科學研究所生產，含孢量為100億/g。藥用小型粉碎機粉碎。

白僵菌菌肥：應用甜葉菊渣發酵物、玉米粉、麥麩和谷殼等生產培養白僵菌，含孢量90億/g。藥用小型粉碎機粉碎。

SDAY選擇性培養基：購于青島高科園海博生物技術有限公司。

1.3 ? 土壤宿存變化動態

1.3.1 ?SDAY選擇性培養基的制作。稱取成品SDAY選擇性培養基80.0g，加熱溶解于1000mL蒸餾水中，分裝，121℃高壓滅菌15min，備用。

1.3.2 試驗小區設置。試驗共設5個處理（見表1）。試驗地選在贛州市林業科學研究所苗圃地（肥水管理一致）的作物間隙選取5塊50cm×50cm的小區，相鄰小區至少間隔1m。取出方格內2cm厚表層土，然后均勻播撒各種試劑;再把表層土平整鋪回對應區內，每小區1個處理。藥后1個月開始取樣，間隔1或2月，即藥后30d（4月）、60d、90d、120d、150d、180d、210d、270d、330d各1次。

1.3.3 ?取樣方法。用圓柱形取樣器（直徑4.5mm），在5種不同的試劑區內用五點式取樣法采集土樣，取樣厚度達15cm。

1.3.4 白僵菌成菌落數（CFU）的測定。（按王濱[4]的方法，并加以改進），用圓柱形取樣器（直徑4.5mm）取出土樣，分別置入裝有100mL 0.05%滅菌吐溫-80溶液的250mL三角瓶中，于快速震蕩器上震蕩30min，使其充分混勻。每個樣品梯度稀釋成10（-3）、10（-4）、10（-5）、10（-6）和10（-7）濃度，每次稀釋后均于快速震蕩器上震蕩30min，充分震蕩均勻。用微量移液管精確移取各濃度土壤懸液0.3mL于制好的選擇性培養基上鋪成平板，每個濃度重復3次。將平板置于25℃恒溫箱中培養10d，觀察、記錄各培養皿中白僵菌成菌落數。以適宜濃度的白僵菌成菌落數作為測定依據（CFU值在10～100間為宜）

1.4 ? 宿存分離株對家蠶毒力測定

供試菌株：從上述A、B、C小區的宿存實驗成菌落數（CFU）的測定中選取培養基內較大的菌落進行對家蠶毒力試驗。

1.4.1 ?孢懸液制備。定期（即藥后60d、120d、210d、270d各1次）從宿存試驗樣地（A、B、C）中分離得到不同的分離株，取純化好的分離株，用0.05%的滅菌吐溫-80溶液稀釋，充分震蕩后接種至SDAY平板培養基中，于25℃恒溫培養箱中培養10d。優選菌落直徑較大的分離株中提取一定量的孢子，用0.05%吐溫-80無菌水，梯度配成1億個/mL濃度的孢懸液。

1.4.2 ?對家蠶毒力測定（浸蟲法）。取20mL孢懸液，挑選大小相近的健康家蠶20頭浸入孢懸液5s，取出后用濾紙吸干蟲體上多余的液體，放入15cm培養皿中，用鮮桑葉喂養。飼養溫度25℃，濕度90%。每處理3個重復。飼養14d，每天觀測家蠶生長狀況，更換新桑葉，將死亡蟲體移出，前3天死蟲不計，第4d開始統計死亡率，連續調查15d。死亡蟲體保濕培養7d，檢查蟲體上是否有菌絲和分生孢子長出，統計僵蟲數。計算死亡率、侵染率。

1.5 ? 數據統計分析

將實驗數據進行方差分析，用Duncan氏新復極差法檢驗差異顯著性。

2 ? 結果與分析

2.1 ? 白僵菌1年中宿存數量動態變化分析

白僵菌在土壤中的宿存受土壤中的生物和非生物的因素影響，其數量動態受土壤濕度、環境溫度和土壤微生物的直接影響，尤其紫外線對表層土壤中的白僵菌殺傷作用，導致孢子的大量死亡[5-7]。以1年為周期，隔1月或2月取樣調查白僵菌種群數量。由圖1所示，起始2月內活性孢子量降低較快，降低速率達65%以上。5～6月隨雨水增多，為白僵菌的腐生生長提供了適宜條件，活性孢子降低速率較小;7～8月高溫干旱降低速率會加大;而10～12月隨著土壤中落葉等的腐熟，土壤中有機質增加了，從而提高了孢子萌發養分，白僵菌種群宿存有上升的趨勢。

受紫外線影響，采取表面撒施的小區活性孢子量降低較快。試驗E和試驗C相比，在1個月后調查測定顯示，試驗E種群數量與初始成菌落數相比降低了88%左右，而試驗C降低了63%。在實際使用中不建議采用土表撒施法，而建議采用覆土法。

不同的混合介質影響白僵菌宿存。試驗劑型（A、B、C）3種介質中，有機質有利于白僵菌在土壤中生長，而草木灰會抑制白僵菌生長。如圖1所示，應用腐熟的有機質生產的白僵菌菌肥其在土壤中的宿存比孢子粉與土壤混配表現更好。

從宿存變化中可看出試驗C與試驗D在土壤中宿存變化相似，但高濃度的試驗D在試驗后的第1個月內降解迅速，可能是土壤中提供不了足夠養分供高濃度的白僵菌生長，導致白僵菌大量死亡。這也說明C措施是較為經濟適應的使用方案。

2.2 ? 宿存菌株毒力分析

從圖2可看出，白僵菌在土壤中的宿存菌株其毒力隨著宿存時間的延長呈下降趨勢。而宿存菌株的致病力和孢子活性受環境溫度、土壤溫度、土壤濕度影響較大，高溫干旱季節（7、8、9月）土壤中白僵菌宿存量及致病性均下降明顯。宿存菌株毒力與僵蟲率呈正相關，毒力越好其僵蟲率也越高。

圖2、圖3中顯示，宿存分離株A和C毒力相近，其毒力和孢子活性保存較良好;宿存分離株B差異顯著，可能是由于試驗B中草木灰pH值呈堿性，明顯地抑制白僵菌生長。

3 ? 結論

試驗證明，白僵菌在土壤中能保持較穩定的毒力，在富含有機質的土壤中能保持一定的再生產孢能力，在土壤中宿存1年后依然保持在103水平上，本試驗也從混合介質與白僵菌的相容性做了初步比較分析，有機質有利于白僵菌生長。白僵菌這種在土壤中較強的宿存能力，較穩定的毒力能達到其它化學農藥無法保證的持續控制效果。在肥料應用層面，白僵菌作為菌肥使用或菌肥劑型開發應用，也具有一般有機肥無法具備持續殺蟲效果，為白僵菌在菌肥方向的應用拓展取得了初步依據。

目前白僵菌在地下害蟲防治上較多地應用于花生蠐螬防治上，其它的害蟲防治應用較少。象白僵菌這種發現較早，但劑型研發嚴重落后的生物殺蟲劑，還有待我們科研工作者提高認識，加強科技研發水平，加大宣傳推廣力度，使白僵菌產品更好地服務于現代農業。（收稿：2019-09-10）

參考文獻：

[1]徐慶豐.我國研究和利用白僵菌防治農林害蟲及有關問題的探討[A].中國蟲生真菌研究與應用（第1卷）[C].北京：學術期刊出版社，1988：1-9.

[2]Pereira R M， Alves S B and Stimac J L.Growth of Beauveria bassiana in fire ant nest soil with amendments[J].JInvertebr Pathol，1993，62：9-12.

[3]Studdert J P and Kaya H K. Water potential， temperature ， and soil type on the formation of Beauveria bassiana soil colonies[J].JInvertebr Pathol，1990，56：380-386.

[4]王濱，聶英奇，李增智，等.白僵菌在土壤中宿存的數量、毒力及產孢量變化研究[J].安徽農業大學學報，2003，30（1）：40-43.

[5]Griffin D M. Soil physical factors and the ecology of soil fungi[J].Biol Rev，1969 （38）：141-166.

[6]Griffin D M. Water potential as a selective factor in the microbial ecology of soils[A].In“Water Potential Relationsin Soil Microbiology”[C].Special Publication，Soil Sci Soc Am，Madison WI，1981：141-151.

[7]Lingg AJand Donaldson M D. Biotic and abiotic factors affecting stability ofBeauveriabassiana in soil[J].JInvertebr Pathol，1981，38：222-230.

作者簡介：郭宗芳（1968-），男，森保工程師，研究方向：農林作物病蟲害防治。