先天性大皰性魚(yú)鱗病樣紅皮病一例KRT1及KRT10基因突變檢測(cè)

于學(xué)萍 孫勇虎 施仲香 周桂芝 劉 紅 張福仁

1濱州醫(yī)學(xué)院，山東煙臺(tái)，264033；2山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬皮膚病醫(yī)院(山東省皮膚病醫(yī)院，山東省皮膚病性病防治研究所)，山東濟(jì)南，250022

先天性大皰性魚(yú)鱗病樣紅皮病(bullous ichthyosiform erythroderma, BCIE)是一種罕見(jiàn)的常染色體顯性遺傳皮膚病，發(fā)病率1/400000～1/100000[1]，約50%有陽(yáng)性家族史[2]。患者的皮膚損害多出現(xiàn)于出生時(shí)或出生后不久[2],通常臨床表現(xiàn)為出生時(shí)即有水皰、鱗屑及紅皮癥，以后發(fā)展為廣泛的角化過(guò)度，主要累及四肢屈側(cè)皮膚，呈灰棕色厚積鱗屑[3]。先前研究表明BCIE是由角蛋白1或10基因(Keratin, KRT)突變引起[1],突變頻率約50%[4]。本研究報(bào)道BCIE散發(fā)病例1例，通過(guò)PCR擴(kuò)增和Sanger直接測(cè)序法對(duì)KRT1及KRT10基因進(jìn)行突變檢測(cè)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 我院皮膚科門診經(jīng)臨床及組織病理確診的1例BCIE患者。先證者，女，6歲。自幼雙下肢皮膚增厚、皸裂、干燥，后波及全身皮膚，以雙下肢為甚，自覺(jué)皮膚緊繃干燥，冬重夏輕，皮損漸重，融合成片(圖1)。皮膚科情況：皮膚干燥，軀干、四肢可見(jiàn)褐色黏著性斑片，皮疹邊界不清。組織病理示：基底層以上棘層松解、細(xì)胞破壞、空泡變性，表皮內(nèi)裂隙形成顆粒層細(xì)胞變性“有大而深染嗜堿顆粒”，角質(zhì)層增厚(圖2a)，DIF顯示：表皮細(xì)胞間及基底膜IgG、C3、IgM、IgA陰性(圖2b)。根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)及病理結(jié)果，診斷為先天性大皰性魚(yú)鱗病樣紅皮病。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取 本研究經(jīng)山東省皮膚病性病防治研究所倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，簽署知情同意書(shū)后，抽取患者及其家屬外周血5 mL，同時(shí)采集100名無(wú)親緣關(guān)系的正常個(gè)體外周血5 mL作為對(duì)照，-80℃保存。采用DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)提取基因組DNA，并用全波長(zhǎng)紫外/可見(jiàn)光掃描分光光度計(jì)ND-8000(Thermo Fisher公司，美國(guó))測(cè)定其純度及含量，將其標(biāo)化為30 ng/μL的DNA模板。

1.2.2 根據(jù)既往報(bào)道的文獻(xiàn)設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增KRT1及KRT10基因全部外顯子及側(cè)翼序列[3]，引物交由北京華大基因科技有限公司合成。25 μL PCR反應(yīng)體系為:PCR taq mix 12.5 μL，dNTP上下游引物各1 μL，DNA模板(30 ng/μL)0.5 μL，ddH2O 10 μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 10 min，變性94℃ 30 s，退火55℃～59℃ 45 s，延伸72℃ 10 min，共進(jìn)行 35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 DNA 測(cè)序 PCR產(chǎn)物經(jīng)醋酸鈉-乙醇沉淀法純化后直接于ABI 3130XL基因分析儀(Applied Bio-systems，美國(guó))上進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 突變分析 所有測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析比對(duì)，用SIFT及Polyphen-2軟件對(duì)基因突變進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果

除KRT10基因7號(hào)外顯子無(wú)法擴(kuò)增出目的條帶外，患者KRT1、KRT10基因的其他外顯子經(jīng)PCR后直接測(cè)序，KRT1未檢測(cè)到突變，KRT10的1號(hào)外顯子第467位存在一雜合點(diǎn)突變，使CGC→CAC,導(dǎo)致KRT10基因所編碼的蛋白第156位氨基酸酸由精氨酸(R)變?yōu)榻M氨酸(H)，即P.R156H，結(jié)果均經(jīng)反向測(cè)序證實(shí)。而家系中非患者及100名正常對(duì)照均無(wú)此點(diǎn)突變(圖3)。

3a：先證者；3b：先證者母親；3c：先證者父親

利用SIFT及Polyphen-2 (http：//genetics.bwh.harvard.edu)對(duì)非同義突變對(duì)蛋白質(zhì)的影響進(jìn)行分析，以上軟件預(yù)測(cè)表明突變p.R156H對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響均為“damaging”。

檢索 Pubmed 和萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)至今發(fā)表的有關(guān)本病KRT1及KRT10基因突變的文章，其中在2000年報(bào)道了一個(gè)日本家系中BCIE患者，與本研究中的患者攜帶相同突變基因[5]。分別于2002年[6]和2011[7]年在兩例中國(guó)患者中均發(fā)現(xiàn)第156位氨基酸的突變，由于第467位堿基發(fā)生G→A雜合突變(c.467G>A) ，而使精氨酸變?yōu)榻M氨酸(p.R156H)。

3 討論

BCIE是角蛋白相關(guān)遺傳性皮膚病的一種，連鎖分析已證實(shí)為角蛋白K1或K10基因突變所致，Mayuzumi等[5]報(bào)道的該突變都發(fā)生于白種人，對(duì)于亞洲人群中這些基因突變的發(fā)生率還知之甚少。K1和K10在分化層的角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)配對(duì)表達(dá)，構(gòu)成角質(zhì)形成細(xì)胞的骨架[1]，它們的正常表達(dá)對(duì)保護(hù)機(jī)體抵御外界刺激，維持細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)及細(xì)胞間的黏著起重要作用[2]。K1和K10的突變可以引起角蛋白中間絲的結(jié)構(gòu)、排列或聚集異常，引起角化過(guò)度、細(xì)胞內(nèi)水腫，從而導(dǎo)致BCIE[8]。另外，K1和K10蛋白還可以抑制細(xì)胞增殖，因此，BCIE后期的主要表現(xiàn)為角化過(guò)度，可能是由于缺乏抑制作用[9]。K1和K10分為螺旋桿狀區(qū)、非螺旋的頭區(qū)和尾區(qū)及連接區(qū)，桿區(qū)又分為1A、1B、2A、2B四個(gè)功能區(qū)，其間由L1、L12、L2三個(gè)非螺旋區(qū)鏈接，在1A起始區(qū)(HIP)及2B結(jié)尾區(qū)(HTP)有兩個(gè)高度保守的區(qū)域,均由20個(gè)氨基酸組成[9]，目前公認(rèn)的致病突變的“熱點(diǎn)”區(qū)域包括：1A中的H1和HIP，L2和HTP。另外，根據(jù)突變位置的不同，臨床表現(xiàn)及皮損輕重程度均有較大差別[2]。

本文報(bào)道患者其臨床表現(xiàn)及組織病理均符合BCIE的診斷。對(duì)K1/K10基因進(jìn)行Sanger測(cè)序發(fā)現(xiàn)，KRT10的1號(hào)外顯子存在錯(cuò)義突變，即c.467G>A(p.R156H)。患者父母及正常對(duì)照者無(wú)此替代，說(shuō)明是突變而不是單核苷酸多態(tài)性[2]。患者無(wú)家族史，說(shuō)明可能為家族中的新發(fā)病例。

K10第156位氨基酸(即1A起始區(qū)的第10個(gè)殘基)的突變是該基因熱點(diǎn)突變中的熱點(diǎn)。此位點(diǎn)上的突變已在多個(gè)種族的BCIE患者中被發(fā)現(xiàn),此位點(diǎn)對(duì)于角蛋白中間絲結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定至關(guān)重要[3,10]。Haruna等[11]分析總結(jié)了31例因K10第156位氨基酸突變引起的BCIE患者的臨床表型,其中23例患者表現(xiàn)為嚴(yán)重的臨床表型，另外6例表現(xiàn)為輕度的臨床癥狀。因此K10基因中第156(R156)位精氨酸殘基是高度保守的，其錯(cuò)義突變可引起多數(shù)患者較嚴(yán)重的臨床表型[9,12]。此位點(diǎn)的精氨酸、組氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、脯氨酸、絲氨酸的替代也均有報(bào)道。孫秀坤等[3]對(duì)國(guó)內(nèi)兩例BCIE患者的研究中，發(fā)現(xiàn)兩例患者均在K10 156位氨基酸上發(fā)生突變，其中突變型為R156P的患者臨床表現(xiàn)嚴(yán)重，而突變型為R156H的患者僅有輕微的臨床癥狀。因此即使突變發(fā)生在同一位點(diǎn)，但替代的氨基酸不同，所致的臨床表現(xiàn)也不同。兩個(gè)氨基酸功能相差越大，經(jīng)替代后的蛋白結(jié)構(gòu)也就相差越大，疾病表型也越嚴(yán)重。先前文獻(xiàn)報(bào)道，K10基因突變所致的BCIE患者一般不累及掌跖部位，本例患者也符合此特征。而K1在掌跖部位的角質(zhì)形成細(xì)胞中有表達(dá)，因此累及掌跖部位的BCIE患者多是由K1基因突變所導(dǎo)致的[2]。

該病目前無(wú)特效藥物治療，主要給予長(zhǎng)期口服阿維A及外用潤(rùn)膚劑、維A酸、角化劑和維生素D的類似物等治療[13,14]。對(duì)受影響個(gè)體的父母和具有相似背景的病例可以接受必要的基因檢測(cè)和遺傳咨詢。本研究為基因診斷和基因治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和診斷依據(jù)，并為進(jìn)一步研究KRT10基因突變與BCIE的關(guān)系提供了依據(jù)。