Beclin1在CO2氣腹促進人卵巢癌細胞SKOV3增殖轉移中的作用

黃金智，謝賢聰，張玲莉，譚曉瑜，張 穎* （.廣東醫科大學附屬醫院婦產科，廣東湛江5400；.廣東醫科大學，廣東湛江 5403）

目前腹腔鏡技術在外科手術中運用越來越廣泛。因腹腔鏡術常需建立CO2氣腹通道，而氣腹可能造成腹部膨脹，導致腹壓上升，某些惡性腫瘤經腹腔鏡術后，由于高壓力的CO2氣腹有可能引發惡性腫瘤的種植轉移[1-2]。為研究Beclin1表達增高在CO2氣腹中是否能夠促進卵巢癌細胞株SKOV3的增殖、遷移，分析其是否存在伴隨CO2氣腹時間延長而提升腫瘤細胞轉移的風險，本課題以卵巢癌細胞株SKOV3為研究對象，模擬CO2氣腹環境，探索促進卵巢癌細胞增值轉移能力的分子機制，為腹腔鏡臨床應用安全性的評估提供依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與試劑

1.1.1 實驗儀器 模塊化培養室和流量計購自比盧普斯羅森堡公司；CO2氣罐和減壓閥購自湛江氧氣廠。

1.1.2 實驗試劑 人卵巢癌細胞株SKOV3購自上海典藏細胞庫；過表達質粒、空質粒、干擾表達質粒及陰性對照質粒購于上海吉瑪公司； Beclin1和GAPDH引物由上海生工生物技術有限公司合成；兔抗人Beclin1多克隆抗體、抗兔單克隆抗體、兔抗人GAPDH單克隆抗體購自美國Abcam公司；Lipofectamine 2000轉染試劑購自Invitrogen公司；Transwell小室購自康寧公司； WST-1試劑盒購自碧云天公司；無內毒素質粒大提試劑盒購自天根公司。

1.2 方法

1.2.1 人工模擬CO2氣腹的建立 采用模塊化孵育箱及其CO2氣罐模擬CO2氣腹環境，進氣壓力恒定，對SKOV3細胞株作用3 h。CO2作用期間將模塊化孵育箱置于細胞培養箱中，盡量與臨床腹腔鏡環境接近，建立人卵巢癌SKOV3細胞株CO2氣腹模型。

1.2.2 實驗分組 采用脂質體介導的瞬時轉染法，分為Beclin1過表達組、對應的GV362空質粒組、Beclin1干擾表達組、對應的pGPH1空質粒組、單純脂質體組(空白對照組)，處理時CO2壓力相同，作用時間相同。

1.2.3 qRT-PCR實驗 5組細胞分別提取細胞總RNA，測定RNA濃度和純度，進行實時熒光定量。

1.2.4 Western blot實驗 5組細胞分別提取總蛋白，BCA(Bicinchoninic acid)法測定蛋白濃度，制備上樣蛋白，免疫印跡以觀察各組蛋白的表達情況。

1.2.5 超氧化物歧化酶法(WST-1)檢測細胞增殖 細胞鋪板，建立模擬氣腹環境，按照試劑盒說明書配置 WST-1 溶液。除上述 5組，另設立空白孔(即無細胞孔，孔內加入同量的培養基)，將各處理組置于細胞培養箱內培養24 h后，經CO2氣腹模型處理3 h，繼續于細胞培養箱培養 24 h，然后每孔加入10 μL WST-1溶液，在細胞培養箱內繼續培養2 h，用酶標儀檢測492 nm 處的吸光度，分析細胞增殖情況。

1.2.6 Transwell細胞遷移實驗 細胞鋪板，建立模擬氣腹環境，5組細胞置于細胞培養箱內培養，轉染質粒，步驟同上。造模后，消化細胞，在Transwell小室的上室接種1×105個細胞，下室內加入500 μL含有2%胎牛血清的 RPMI1640 培養液，培養2 h，建立CO2氣腹，然后進行固定、染色，顯微鏡高倍鏡下觀察細胞遷移情況并計數，對比各組遷移細胞數的差異。

1.3 統計學處理

采用GraphPad Prism 5進行數據分析。計量資料采用±s表示，多個樣本之間的比較，滿足方差齊性的條件下采用單因素方差分析及LSD檢驗，不滿足方差齊性的條件下采用單因素方差分析及Dunnett T 3檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 轉染效果

轉染24 h后觀察熒光表達，隨機5個高倍鏡熒光表達如圖1，轉染效率為40%～50%，轉染成功。

圖1 轉染24 h后熒光表達 (×400)

2.2 Beclin1的mRNA表達情況

RT-PCR檢測Beclin1的mRNA表達情況，由圖2可知：與脂質體空白對照組和空質粒(轉染各自的空載體質粒GV362和pGPH1)組相比，轉染Beclin1過表達質粒組的Beclin1 mRNA表達明顯增高，而轉染Beclin1干擾表達質粒組的Beclin1 mRNA表達則明顯受到抑制，差異均有統計學意義(P<0.05)。空白對照組與空質粒組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3 Beclin1蛋白表達情況

Western blot檢測Beclin1的表達情況，由圖3、4可知，Beclin1過表達組與脂質體空白對照組和GV362空質粒組比較，Beclin1蛋白表達明顯增高；Beclin1干擾表達組與脂質體空白對照組和pGPH1空質粒組比較，Beclin1蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)?？瞻讓φ战M與空質粒組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4 WST-1細胞增殖結果

WST-1細胞增殖結果如圖5所示，Beclin1過表達組與脂質體空白對照組和GV362空質粒組比較，細胞增值率明顯增高；Beclin1干擾表達組與脂質體空白對照組和pGPH1空質粒組比較，細胞增殖率則明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)?？瞻讓φ战M與空質粒組差異無統計學意義(P>0.05)。

圖3 Beclin1的蛋白表達情況

2.5 Tanswell細胞遷移

Tanswell小室遷移結果如圖6、7所示，Beclin1過表達組與脂質體空白對照組和GV362空質粒組比較，遷移入下室的細胞明顯增多；Beclin1干擾表達組與脂質體空白對照組和pGPH1空質粒組比較，遷移入下室的細胞明顯減少，差異均有統計學意義(P<0.05)?？瞻讓φ战M與空質粒組差異無統計學意義(P>0.05)。

圖4 各組Beclin1蛋白相對表達量的比較

圖5 各組細胞增殖率的比較

圖6 各組細胞結晶紫染色在高倍顯微鏡下的結果(×200)

圖7 各組細胞遷移數的比較

3 討論

目前腹腔鏡技術已運用于多種普通腹部外科疾病的診治。但近年來研究發現某些惡性腫瘤經腹腔鏡術后，容易出現穿刺孔或腹腔內轉移[1-2]，其在治療惡性腫瘤中的應用，醫學界出現一些異議。因為腹腔鏡術中通常需建立CO2氣腹通道，而氣腹可能造成腹部膨脹，導致腹壓上升。相關研究表明高壓力CO2氣腹產生的機械性壓迫和CO2吸收所致的不利影響表現在呼吸、循環、消化、神經內分泌和炎性應激等多個方面[3-6]。其中最令人關注的是高壓力的CO2氣腹有可能引發惡性腫瘤的種植轉移。CO2氣腹促進腫瘤生長和擴散, 主要反映在CO2氣腹會增加創口腫瘤細胞的沾染機會，其酸性環境有利于腫瘤細胞的生長，易引起腹膜、內臟缺血，影響機體免疫力，導致腫瘤擴散。CO2氣腹不僅可以影響腹膜及細胞微環境，甚至對腫瘤細胞基因及相關因子產生影響，最終引起腫瘤細胞增殖及侵襲能力的改變。

Beclin1是重要的自噬相關基因，本課題在CO2處理下，發現上調Beclin1基因的過表達，SKOV3發生了增殖轉移，而抑制Beclin1基因的表達后，SKOV3細胞的增殖轉移明顯降低，這提示CO2氣腹可能通過上調Beclin1基因的表達，進而誘導自噬的發生，增強了人卵巢癌細胞株SKOV3的活力以及抵御不良環境的能力，從而使細胞增殖及遷移能力增強，促進了卵巢癌的生長和轉移。有研究證實，饑餓狀態下的卵巢癌SKOV3細胞能迅速誘導自噬的發生，而在使用自噬抑制劑或干擾Beclin1表達后，卵巢癌細胞的活力降低，細胞的生長增殖能力被抑制[7]。Beclin1促進卵巢癌細胞株 SKOV3的增殖轉移可能是因為CO2制造的缺氧饑餓環境，但其發揮作用的具體機制還不明確。

早期部分學者認為CO2氣腹有促進惡性腫瘤增殖的作用。然而近年來，許多學者的研究卻得出了相反的結論，即CO2氣腹環境對腫瘤細胞的生長增殖有抑制作用。Cai等[8]在體外研究還發現, 濕潤的CO2可以用來治療和預防結腸癌腹腔種植。因此，CO2氣腹對腫瘤細胞種植和增殖轉移的影響不能一概而論，還需要不斷深入研究。