細胞衰老分子機制的研究進展

徐 舜，崔紅晶，趙 煒，孫雪榮，袁 源，鄭婷婷，熊 興東，劉新光 （廣東醫科大學衰老研究所，廣東省醫學分子診斷重點實驗室，廣東東莞 523808）

人口老齡化已成為當今世界各國面臨的日趨嚴重的社會問題。衰老作為生命過程中的一種生理現象，是指隨著個體年齡的增長，細胞、組織、器官發生系統性病變，從而導致衰老相關疾病發生和壽命終結的現象，主要表現為細胞的增殖能力減退，甚至完全停滯，臟器萎縮、機能衰退等[1-2]。與衰老密切相關的疾病，如糖尿病、心血管疾病、神經退行性疾病、腫瘤、代謝性疾病等，已成為人類健康的重要威脅。2013年法國學者提出了衰老的九大分子指標：(1)基因組不穩定；(2)端粒縮短；(3)表觀遺傳學改變；(4)蛋白內穩態喪失；(5)營養感應失調；(6)線粒體功能異常；(7)細胞衰老；(8)干細胞耗竭；(9)細胞間通訊改變[1]。細胞衰老是指細胞在執行生命活動過程中，隨著時間的推移，細胞增殖與分化能力和生理功能逐漸發生衰退的變化過程[1-2]。最近有文獻指出，細胞衰老是一種由壓力信號刺激產生，存在于特定生理過程的細胞狀態，具有典型的細胞周期停滯、衰老相關分泌表型、大分子損傷及代謝紊亂4大特征[3]。細胞衰老涉及的分子機制較多，氧自由基學說認為細胞衰老是機體代謝產生的氧自由基對細胞損傷的積累[4]。端粒學說提出細胞染色體端粒縮短的衰老生物鐘理論，認為細胞染色體末端特殊結構-端粒的長度決定了細胞的壽命。DNA損傷衰老學說認為細胞衰老是DNA損傷的積累。基因衰老學說認為細胞衰老受衰老相關基因的調控。分子交聯學說則認為生物大分子之間形成交聯導致細胞衰老，也有學者認為，脂褐素蓄積、糖基化反應以及細胞在蛋白質合成中難免發生的誤差等因素導致細胞衰老。對于衰老的生物學機制的深入研究，既是當前生命科學領域的重要前沿，又是社會經濟和醫療衛生發展面臨的重大挑戰。由于人類的生命周期較長，正常的衰老過程不易研究，因此衰老研究通常利用衰老動物模型(如酵母、線蟲、斑馬魚、小鼠等)完成，進而揭示衰老過程的分子機制。

本課題組自2006年開始從事衰老及其相關疾病的分子機制研究，我校于2007年成立了衰老研究所，10多年來在細胞衰老的分子機制的研究方面獲得了14項國家自然科學基金項目，開展了系列研究。本文將結合本課題組的工作就細胞衰老的分子機制作一綜述。

1 非編碼RNA與細胞衰老

長期以來，人們對細胞衰老分子機制的研究主要集中在蛋白編碼基因。然而，在高等哺乳動物轉錄產物中，90%以上是非編碼 RNA(non-coding RNA，ncRNA)，主要包括微小RNA(microRNA，miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)和環狀RNA(circular RNA，circRNA)等。非編碼RNA可在表觀遺傳、轉錄水平以及轉錄后水平等多層次調控基因的表達，從而廣泛參與多種生物學過程。近年來，非編碼RNA在細胞衰老中的作用日益受到關注，并取得了長足發展。

miRNA是一類高度保守的、長度約為22 nt的非編碼小RNA分子，通過與靶基因mRNA 3'UTR的結合，引起mRNA的降解或者翻譯阻滯，從而在轉錄后水平實現對靶基因的負調控[5]。越來越多的研究顯示，miRNA在細胞衰老過程中發揮至關重要的作用，miR-34a[6]、 miR-29[7]、 miR-217[8]及miR-17-92家族[9]等多個miRNAs可通過負調控衰老相關信號通路中的靶基因影響細胞衰老進程。近年來，本課題組揭示了包括miR-365、miR-33和miR-124等多個miRNA在細胞衰老與早老中發揮重要作用。

LncRNAs是一類轉錄本長度大于200個核苷酸，缺乏蛋白質編碼能力的功能性RNA分子[10]，最初被認為是基因組轉錄的“噪音”，是RNA聚合酶Ⅱ轉錄的副產物，不具有生物學功能。但近年的研究表明，lncRNAs能與蛋白直接相互作用，并在多個層次調節靶基因的表達或相互作用蛋白的穩定性、活性等，從而參與調節細胞增殖、分化和凋亡等生物學過程[11]。LncRNAH19可通過抑制STAT3信號通路，參與調節內皮細胞衰老[12]。MIR31HG則可通過調節P16蛋白的表達影響細胞衰老進程[12]。此外，lncRNA-OIS1可通過激活DPP4從而促進RAS誘導的細胞衰老(OIS)[14]。本課題組發現長鏈非編碼RNA AK156230可參與調節小鼠胚胎成纖維細胞復制性衰老進程[15]。

環狀RNA是一類具有閉合環狀結構的內源性RNA分子，主要由前體RNA(pre-mRNA)通過可變剪切加工產生。它廣泛存在于各種細胞中，具有表達豐度高、結構穩定和組織特異性表達等特征[16]。越來越多的研究表明，circRNA可作為miRNA和蛋白質“海綿”調控相應靶基因的表達，或者通過與核內蛋白結合形成轉錄復合物調控基因轉錄等方式發揮其生物學功能[16]。有研究表明，環狀RNA在細胞衰老的過程中發揮重要的作用。例如，Panda等[17]在人二倍體成纖維細胞WI-38中發現大量與衰老相關的環狀RNA(SAC-RNAs)。其中，circPVT1可通過ceRNA的作用方式抑制let-7的活性并調控其靶基因的表達，從而影響細胞的增殖和衰老[17]。Du等[18]發現circ-Foxo3在年老的人與小鼠心臟中高表達。體外實驗表明，沉默circ-Foxo3可抑制小鼠胚胎成纖維細胞的衰老，而過表達circ-Foxo3可誘導其衰老。過表達circ-Foxo3導致抗衰老蛋白ID1、轉錄因子E2F1、抗應激蛋白HIF1a和FAK滯留于胞質，而在胞核中的豐度降低，從而阻斷這些蛋白質發揮抗心肌細胞衰老的功能。此外，還有研究發現，circFoxo3與CDK2和p21結合，形成circFoxo3-p21-CDK2三元復合物，從而抑制CDK2的功能并阻止細胞周期進展[19]。近年來本課題組非編碼RNA與細胞衰老進程研究詳見表1[20-25]。

2 細胞應激反應與衰老

細胞和機體在生長過程中難免會受到內外各種環境的影響，例如氧化應激、內質網應激、滲透壓力、熱應激、營養/代謝壓力、DNA損傷等[26]。細胞因此進化出一系列適應性的調控機制，影響相關基因的表達，這種反應稱為細胞應激。如果細胞內的這套應激調控機制失衡，就會導致細胞死亡，衰老或癌變[27]。

研究發現，在機體衰老和衰老相關疾病發生過程中，細胞內的應激反應和相應的修復機制都出現紊亂趨勢[28]。從某種程度上來說，衰老是細胞損傷和修復機制之間的博弈[29]。

表1 近年來本課題組非編碼RNA與細胞衰老進程研究進展

細胞應激反應與衰老之間存在著較為復雜的關系，長壽細胞通常對某些特定的應激因素表現出抗性[26,30-31]，本課題組在衰老模式生物釀酒酵母中發現多個短壽命酵母菌株，都表現出對氧化應激、DNA損傷等環境壓力的敏感性，例如NAR1[32]、KSP1[33]、UBI4[34]、CIA2[35]、MET18[36]。目前研究認為，適當的應激反應可以誘導細胞產生相關的分子伴侶和保護性白蛋白，進而延長壽命；然而，過強的應激將加速細胞衰老(圖1)。這種應激反應與壽命間的關系被定義為“毒物興奮效應”[37]，目前研究較多的主要有內質網應激和氧化應激反應。

圖1 細胞應激反應和衰老之間的關系

內質網應激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)是真核細胞的一種保護性應激反應, 細胞通過內質網應激可以降低內質網中堆積的未折疊蛋白及錯誤折疊蛋白。未折疊蛋白可以激活未折疊蛋白質反應(Unfolded protein response，UPR)，進而增強內質網對未折疊或錯誤折疊蛋白質的處理能力，減輕ERS壓力，維持內質網的內環境穩態。但是，持續的內質網應激反應則會誘導細胞凋亡和死亡[38]。

哺乳動物細胞中有3條互相關聯的UPR通路(IRE1、PERK和ATF6)共同參與調控內質網蛋白的動態平衡，而在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)細胞中目前只發現由轉錄因子(Homologous to ATF/CREB 1，Hac1p)和ERS感應因子需肌醇酶1(Inositol Requiring Enzyme 1，Ire1p)共同介導的UPR信號通路，調控方式相對簡單[38-39]。

研究報道，釀酒酵母缺失ALG12基因能延長細胞復制性壽命，其機制與細胞內上調的UPR通路活性相關[40]；本課題組也發現，缺失蛋白質-O-甘露糖轉移酶1(Protein O-mannosyltransferase 1，PMT1)基因同樣可以通過上調細胞內的UPR活性來延長酵母細胞的復制壽命[41]。

氧化應激是細胞內活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)生成能力與細胞的活性氧清除能力失衡所致，進而導致諸如DNA、蛋白質等生物大分子損傷的累積，這也是衰老“自由基學說”的核心內容[4]。

氧化應激和內質網應激一樣，都像一把雙刃劍，對細胞存在雙重調控作用：適度的ROS可以作為第二信使激活多個轉錄因子，例如NF-κB、HIF-1α以及NRF2，進而調控細胞分化、細胞增殖與侵襲、血管生成[42-43]。但是，細胞內過量的ROS會誘發DNA突變，使DNA編碼序列發生氧化損傷，從而使基因表達發生改變；還可通過改變DNA甲基化修飾影響基因的表達；此外，ROS還可使脂質氧化、蛋白質過氧化、分子交聯等，最終導致細胞發生凋亡、衰老，甚至癌變。

細胞為了防御ROS對機體的氧化損傷，進化出一套完整的抗氧化系統。正常情況下，機體內ROS的產生和消除處于動態平衡狀態。在衰老過程中，由于多種因素，細胞清除ROS的能力出現衰減的趨勢，從而處于氧化應激狀態。研究發現，氧化應激介導的細胞衰老途徑主要包括DNA損傷通路[44]、NF-κB通路[45]和 p38MAPKs通路[46]。

細胞應激反應和衰老之間的相互調控關系一直都是衰老研究的熱點，如何控制細胞應激反應的“度”，如何通過干預手段充分發揮細胞應激在衰老中的積極作用，都是目前亟待解決的關鍵問題，也是抗衰老藥物研發的重要方向[47]。

3 能量代謝與衰老

能量代謝的改變與衰老進程以及衰老相關疾病的發生發展密不可分[48]。衰老細胞能量代謝的改變主要表現在線粒體功能的減弱及胰島素/IGF-1(胰島素/胰島素樣生長因子，Insulin/IGF-1)信號通路等能量代謝通路的改變。衰老細胞中線粒體功能減弱，表現為膜電位降低、質子泄漏增加、融合和分裂率降低、質量增加和三羧酸循環代謝物種類增加[49]。雖然衰老細胞中線粒體的數量可能逐漸增加，但其產生ATP的能力受到損害[50]。衰老動物包括人類中糖酵解增加，同時組織和血清中乳酸增加，表明衰老動物中有氧代謝減少，無氧代謝增加，ATP的生成效率明顯下降[51]。衰老細胞線粒體的功能受到損傷，產生更多能引起蛋白質和脂質損傷的ROS，同時ROS還會導致端粒的縮短以及DNA損傷應答的活化[52]。Insulin /IGF-1信號通路是從酵母到哺乳動物及人類對長壽和衰老影響最大的通路之一[53]。抑制insulin /IGF-1通路后，可通過控制能量代謝延長酵母、線蟲、果蠅和小鼠等模式生物的壽命[54-55]。這與能量限制(CR)可以通過激活AMPK通路、抑制TOR通路以及促進自噬延長壽命一致。因此，能量代謝通過線粒體功能減弱及胰島素/IGF-1信號通路等能量代謝通路影響細胞衰老。

本課題組致力于糖異生過程的關鍵酶磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1(PCK1)的研究，其廣泛存在于肝臟、腎臟、白色和褐色脂肪組織中。PCK1的表達受兩種不同的激素機制調控，包括腎上腺皮質分泌的皮質醇和胰島A細胞分泌的胰高血糖素。胰高血糖素/胰島素比值升高可誘導大量的PCK1生成，從而促進糖異生作用。因此，PCK1蛋白在調節并維持能量代謝尤其是糖代謝過程中發揮至關重要的作用。我們的研究結果表明，在酵母細胞中PCK1缺失可通過抑制糖異生產生和促進糖酵解產生更多乳酸等中間產物，從而誘導ROS的產生和6-磷酸果糖激酶1的表達產生，最終促進細胞衰老(待發表結果)。

4 衰老相關分泌表型

衰老細胞會分泌大量的細胞因子，這種現象稱為衰老相關分泌表型(senescent associated secretory phenotype, SASP)，為敘述方便，本文將這些細胞因子統稱為SASP因子。SASP因子種類繁多，包括促炎癥細胞因子、趨化因子、生長因子和基質金屬蛋白酶等(圖2、表2)[56-57]。SASP因子介導了衰老細胞的許多生物學效應，其既是衰老細胞的標志，也可以通過自分泌和旁分泌的方式，加強和傳播衰老[56,58]。SASP因子可以激活免疫系統，促進衰老細胞的清除[59-60]。SASP因子還參與傷口愈合、組織重塑等過程的調節[61-62]，但持續存在的SASP因子也會造成整體或局部的慢性炎癥等，并可促進腫瘤生長[61]。本課題組的研究表明，在順鉑作用下，黑色素瘤通過發生衰老并分泌SASP因子，對抗順鉑的治療作用，從而導致治療失敗；而用中和抗體對抗關鍵SASP因子(如IL-1a和IL-8)，可顯著改善順鉑的治療效果[64]。因此，SASP因子對機體的影響非常復雜，可能利大于弊，也可能相反，需根據具體情況進行分析。

衰老細胞的細胞周期停滯常與p16INK4A/RB或p53/p21通路激活有關，但這兩條通路并不促進SASP的發生。調節SASP發生的信號通路主要包括NF-κB、 C/EBPβ(CCAAT/enhancer binding protein beta)、cGAS-STING(Cgmp-Amp synthase-stimulator of interferon genes)、GATA4(GATA Binding Protein 4)、 mTOR(Mammalian target of rapamycin)和 p38-MAPK等[64-68]。很多衰老誘導因子，如DNA損傷、胞漿染色質片段及損傷相關模式分子等，可通過調節這些信號通路而激活SASP[69-70]。

在不同衰老誘因、不同細胞類型及不同微環境下，產生的SASP因子種類和數量有很大的差異[71]。單細胞RNA測序結果進一步表明，不同細胞間SASP因子的表達量也存在明顯差異[71]。造成細胞間異質性的原因之一在于，SASP是一個動態發展過程，IL-1α是SASP早期的分泌因子，其可促進多種SASP因子的產生[72]，而在后期，細胞可通過負反饋調節(如產生miRNA)，抑制SASP發展，從而降低其不利影響。

5 干細胞耗竭

干細胞耗竭可導致組織的再生功能下降，是機體衰老最明顯的特征之一[1,73]。機體的造血功能隨年齡增長而下降，對老年小鼠的研究顯示，造血干細胞(HSCs)的細胞周期活性總體下降，同時老年HSCs的細胞分裂次數少于年輕HSCs[74]，這與DNA損傷積累[75]和 細胞周期抑制蛋白(如p16INK4a) 過度表達[76]相關。造血功能下降除可引起貧血和惡性腫瘤等疾病外，還可導致適應性免疫細胞生成減少，從而促進免疫衰老[77]。在幾乎所有的成體干細胞區室中，均發現了相似的干細胞功能性耗竭，包括小鼠前腦、骨髓和骨骼肌[78-79]。端粒縮短是多種成體干細胞隨年齡增長而衰退的重要原因[78-80]。目前，干細胞耗竭已成為抗衰老研究的重要靶點[1,73]。

圖2 衰老細胞SASP因子的生物學功能[56]

表2 衰老相關分泌表型(SASP)成分[56]

6 免疫與衰老

免疫系統在衰老過程中出現明顯變化，衰老過程中免疫參數的下降被稱為免疫衰老。免疫衰老能引起促炎性因子的亞臨床累積與炎性衰老，通常被認為是有害的。并且，免疫衰老與炎性衰老被認為是大多數老年人疾病的根源，如感染、癌癥、自身免疫性疾病等[81]。但近年來的研究對免疫衰老的負面解釋提出了挑戰。

固有免疫系統在衰老過程中的主要特征是基礎水平的免疫刺激以及當需要特定功能(如產生自由基)時的免疫麻痹[82]，這兩方面都與炎性衰老密切相關。20年前，Franceschi等[83]提出炎性衰老的概念，認為衰老就是一種慢性、無菌、低度的炎癥。炎性衰老狀態是線粒體功能異常、自噬/吞噬功能缺陷、內質網應激、細胞碎片和錯誤定位的自身分子對炎癥小體的激活、泛素/蛋白酶系統缺陷、DNA損傷反應的激活、衰老的T細胞及其SASP因子、年齡相關的腸道菌群的變化等綜合產生的結果[84-86]。由于慢性低度的炎癥，免疫細胞一直保持警惕狀態，其必然結果就是固有免疫功能的下調或免疫麻痹，這也是固有免疫耐受的一種[82]。這種生理狀態可以保護生物體免受進一步自我誘導的損害，即使是以損害病原體防御為代價。另外，自由基產生量低可以保護機體免受與衰老和氧化應激有關的進一步損害，趨化活性的降低在無菌發炎過程中可以防止過度的組織損傷，維持抗炎的M2型巨噬細胞所需的能量比維持促炎的M1型巨噬細胞要少很多[87]。因而，通過慢性炎癥維持生理完整性而不是不惜一切代價消滅病原體，有可能是固有免疫系統在衰老過程中的適應性改變。另外，近年來發現的訓練性固有免疫記憶也有可能導致固有免疫細胞處于持續激活狀態[88]。Kleinnijenhuis等[89]發現，在卡介苗BCG刺激3個月后，單核細胞和巨噬細胞仍能夠在不存在BCG的情況對其他任何刺激進行反應。這說明即使沒有特定的刺激，訓練過的免疫記憶也有可能導致持續的激活狀態。因此，衰老過程中固有免疫系統的改變也不僅僅是由于衰老產生的。

適應性免疫系統在衰老過程中出現的特征性變化是初始型T細胞的減少和記憶性T細胞的增加[90]。其中初始型T細胞的減少是由胸腺退化、一生中急性和慢性抗原的刺激以及年齡相關的造血干細胞功能不全引起的，主要會導致TCR庫減少，這是衰老中適應性免疫系統最基本的變化，被認為是老年人感染、癌癥以及疫苗接種失敗率升高的主要原因[91-93]。但新的研究對該觀點提出質疑。首先，IL-7刺激初始型T細胞增殖能部分替代退化的胸腺，干細胞樣記憶性T細胞也能參與補充T細胞[94]。其次，有研究表明具有更多的初始型CD8+T細胞并不代表具有更多的生存優勢[95]。另外，胸腺退化也可能有一些進化上的原因，因為在整個機體趨于減少衰老過程中能量消耗的情況下，維持如此代謝活躍的器官是非常耗資源的，并且衰老的機體通常已經遇到了其居住區域大多數活躍的病原體。老年人因直接傳染性原因死亡的概率并不高，說明衰老中對新型病原體反應能力下降的代價并不大，胸腺退化反而能節省能量消耗從而支撐其他生存所需的功能和活動。記憶性T細胞的數量的增加對于衰老的機體有可能是非常有益的。人體具有許多潛在的感染，可以在特定條件下不時重新激活，比如巨細胞病毒[96]。目前研究認為，巨細胞病毒感染的存在不僅僅有害，它維持的持續免疫警覺性有利于更好的免疫反應，其抗原的總體反應甚至與更好的存活率有關[97]。因此，同固有免疫系統類似，衰老過程中適應性免疫系統的變化不應被認為一定是有害的或者僅僅與衰老有關。

衰老過程中免疫細胞代謝功能受損近年來受到越來越多的關注。T細胞亞型的分化與所使用的特定代謝途徑有關，并且有研究顯示年輕人和老年人的T細胞代謝存在差異[98]。老年人的T細胞缺乏足夠的底物來支持線粒體呼吸，因此能量缺乏，而沒有分解的葡萄糖被轉移到磷酸戊糖途徑，促進了還原性因素(尤其是NADPH和還原型谷胱甘肽)的積累以及活性氧的清除[99]。能量缺乏的T細胞上調了能量傳感器AMPK的激活，衰老T細胞中AMPK過度激活的下游靶標是DUSP4，DUSP4負調控MAPK超家族的成員ERK1、ERK2和JNK[100]。ERK是T細胞受體信號轉導級聯的關鍵調節因子，其被DUSP4去磷酸化后能削弱TCR誘導的信號并減弱T細胞功能。因此，在確定葡萄糖，氨基酸和脂質等外源營養物對免疫衰老的影響時需考慮衰老過程中其本身的變化。

衰老引起的免疫系統的修飾或調節不僅僅導致免疫系統的最終惡化，也使其更適應特定環境中的挑戰。因此，Fulop等[101]提出免疫衰老是由于慢性侵略和時間造成的免疫適應與重塑，他們認為免疫系統中許多或大多數與年齡相關的變化可能是對衰老過程的理想適應，單一的免疫干預有可能造成潛在的長期傷害。免疫系統是一個龐大復雜的系統，并與中樞和周圍神經系統、內分泌系統等相互影響。目前還需要進一步更廣泛的研究提出新的免疫干預目標以減少衰老的有害影響，并利用有益的影響改善老年人的健康和功能。

7 展望

細胞衰老的發生發展是多因素參與、一系列基因協同調節的綜合結果。在過去20年里，有關細胞衰老發生機制的研究已取得了較大進展，并提出多種衰老相關假說，揭示了多個衰老相關信號轉導通路。近年來，本課題組致力于研究衰老發生機制，鑒定潛在的抗衰老靶標及抗衰老藥物，取得了一定的進展。盡管如此，衰老與抗衰老是一個永恒的話題，衰老及衰老相關疾病發生機制依然有待深入研究。隨著技術的革新和知識的擴充，越來越多的研究提示包括腸道菌群、RNA甲基化修飾等多種因素在衰老進程中也可能扮演至關重要的角色。本課題組將基于前期研究基礎，結合多種新技術、新策略、新領域，繼續深入探討細胞衰老及衰老相關疾病的發生機制。