三葉青多糖提取工藝優(yōu)化及單糖組成分析

呂蘭 陳紅梅

摘 ? 要 ? 為優(yōu)化三葉青多糖的提取工藝，并分析其單糖組成，通過正交試驗設(shè)計方法優(yōu)選三葉青多糖的最佳提取工藝，同時，采用柱前衍生化-高效液相色譜法來測定單糖組成。結(jié)果表明：三葉青多糖的最佳提取工藝為料液體積比1∶25，提取2次，每次2.5 h，醇沉濃度70%。該方法對多糖提取率為7.40%;柱前衍生化-高效液相色譜法分析得三葉青多糖主要由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、巖藻糖、半乳糖、阿拉伯糖等單糖組成。本實驗方法簡單可行。

關(guān)鍵詞 ? 三葉青多糖;提取工藝;單糖;柱前衍生化

中圖分類號：Q599 ? ?文獻標(biāo)志碼：A ? ?DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.1.002

葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg），別名三葉青、金絲吊葫蘆、絲線吊金鐘、三葉扁藤等，分布于浙江、福建、江西等地[1-2]，是新“浙八味”之一[3]。三葉青性涼、無毒、味甘微苦，有清熱解毒、活血止痛、祛風(fēng)、化痰等功效[4]，常用于治療高熱驚厥、肺炎、肝炎、風(fēng)濕、咽痛、瘰疬、癰疔瘡癤等[5-6]。三葉青的化學(xué)成分有黃酮類、萜類、多糖類、酚類、氨基酸、甾體類、油脂類等[7]。目前，關(guān)于三葉青多糖的研究較少[8]，本文旨在對三葉青多糖提取工藝優(yōu)化及其單糖組成進行分析，為三葉青多糖的研究和開發(fā)利用提供一定的實驗基礎(chǔ)及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

AE240電子天平（瑞士METTLER公司），HH-S數(shù)控恒水浴鍋（金華市文華科教實驗儀器廠），低溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)一體機（日本YAMATO公司），SHIMADZU UV-2450 紫外分光光度儀（日本SHIMADZU公司），VD115真空干燥器（德國BINDER公司），515型HPLC系統(tǒng)（美國Waters公司），LC 20vp HPLC系統(tǒng)（日本SHIMADZU公司）。

三葉青藥材（杭州華東中藥飲片有限公司，批號：151119、151212、151220）;無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)對照品（KAYON公司，批號：20111203）;甘露糖（Man）、鼠李糖（Rham）、半乳糖醛酸（GalUA）、葡萄糖醛酸（GlcUA）、氨基葡萄糖（GlcN）、氨基半乳糖（GalN）、葡萄糖（Glc）、阿拉伯糖（Ara）、巖藻糖（Fuc）和半乳糖（Gal），共10種單糖標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma-Aldrich 公司）;乙腈（色譜純，德國MERCK公司）;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 三葉青多糖含量測定

1.2.1.1供試品溶液的制備

取三葉青藥材飲片適量，打粉，過三號篩，精密稱取100 g粉末，加30倍蒸餾水，回流提取3次，每次1 h，收集3次濾液并合并，濃縮至2 L，然后用Sevage法（樣品溶液、二氯甲烷、正丁醇的體積比為25∶4∶1）脫蛋白，加無水乙醇，醇沉過夜，干燥沉淀物，得三葉青粗多糖，粗多糖加水溶解，定容至1 L，得供試品溶液。

1.2.1.2對照品溶液的制備

精密稱取105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖適量，精密稱定，加水制成0.246 mg·mL-1的對照品溶液。

1.2.1.3檢測波長的選擇

精密吸取供試品溶液 1 mL、對照品溶液0.5 mL，置于具塞比色管中，加蒸餾水至2 mL，精密加入1 mL的5%苯酚溶液，搖勻，準(zhǔn)確移取濃H2SO4 5 mL，迅速搖勻后，放置5 min，置沸水浴中加熱30 min，取出，放入冰水浴中冷卻20 min，在400～600 nm范圍對其進行掃描，選擇最大吸收波長作為檢測波長[9]。

1.2.1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液250、500、750、1 000、1 250、1 500 ?L于具塞試管中，分別加蒸餾水定容至2 mL，得系列對照品溶液，精密加入1 mL 5%苯酚溶液及5 mL的濃H2SO4溶液，80 ℃水浴提取，取出后放入冰水浴中，冷卻20 min，以蒸餾水作為空白，用分光光度計在490 nm處測定吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)（C），吸光度為縱坐標(biāo)（A），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.5含量測定

精密吸取2 mL供試品溶液，按“1.2.1.4”項下操作測定吸光度，計算三葉青多糖含量[10]。

1.2.2 方法學(xué)考察

1.2.2.1精密度實驗

精密吸取供試品溶液2 mL，按“1.2.1.4”項下操作測定吸光度，連續(xù)測定5次，計算RSD值。

1.2.2.2穩(wěn)定性試驗

精密吸取2 mL供試品溶液，按“1.2.1.4”項下操作，分別在30、60、90、120、150、180 min測定吸光度。計算RSD值。

1.2.2.3重復(fù)性試驗

精密稱取6份干燥后的三葉青樣品，分別提取，每份供試品溶液取2 mL，置于試管中，按“1.2.1.4”項下操作，依法測定吸光度，計算RSD值[11]。

1.2.2.4加樣回收試驗

精密吸取已知濃度的同一供試品溶液1 mL，共9份，分別加入適量多糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL，按“1.2.1.4”項下操作，依法測定吸光度，計算其平均加樣回收率和RSD值[12]。

1.2.3 三葉青多糖提取工藝優(yōu)化（單因素試驗）

1.2.3.1提取時間

固定提取溫度100 ℃，料液比（均為體積比，下同）1∶30，醇沉濃度90%，改變提取時間（0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h），提取2次，提取三葉青多糖，計算三葉青多糖的提取率。

1.2.3.2提取次數(shù)

固定提取溫度100 ℃，提取時間為2 h，料液比1∶30，醇沉濃度90%，改變提取次數(shù)（1次、2次、3次、4次、5次）提取三葉青多糖，計算三葉青多糖的提取率。

1.2.3.3料液比

固定提取溫度100 ℃、提取時間為2 h，提取次數(shù)2次，醇沉濃度90%，改變料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）提取三葉青多糖，計算三葉青多糖的提取率。

1.2.3.4醇沉濃度

固定提取溫度100 ℃、提取時間為2 h，提取次數(shù)2次，料液比1∶30，改變醇沉濃度（60%、70%、80%、90%、95%）提取三葉青多糖，計算三葉青多糖的提取率。

1.2.4 三葉青多糖提取條件優(yōu)化

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以提取時間（A）、提取次數(shù)（B）、料液比（C）和醇沉濃度（D）為考察因素，設(shè)計L9（34）正交試驗。

1.2.5 三葉青多糖的單糖組成測定

1.2.5.1混合單糖對照品的衍生化[13-14]

分別精密稱取各單糖對照品4 mg置10 mL量瓶中，加水溶解混勻，定容得0.4 mg·mL-1混合單糖對照品儲備液。精密量取稀釋后的混合單糖對照品溶液100 μL，于具塞試管中，依次加入0.5 mol ·L-1 PMP甲醇溶液100 μL和 0.3 mol ·L-1的NaOH溶液100 μL，混勻，70 ℃水浴反應(yīng)30 min，取出冷卻至室溫，加入0.3 mol ·L-1的HCl 100 μL進行中和，再加入1 mL氯仿萃取，充分震蕩，棄氯仿層，重復(fù)3次，取上清液定容至1 mL，0.45 μm微孔濾膜濾過，10 μL進樣分析。

1.2.5.2供試品的衍生化[15]

精密稱取三葉青多糖4 mg置于2 mL量瓶中，溶解并定容。精密吸取100 μL置于安瓿瓶中，加入1 mol ·L-1 TFA 2 mL，100 ℃水解8 h，冷卻至室溫，以1 mol ·L-1 NaOH溶液調(diào)pH值為7，以純化水稀釋并定容至5 mL，過濾，取續(xù)濾液，按“1.2.5.1”項下的方法進行衍生化處理。

1.2.5.3色譜條件

色譜柱ZORBAX SB-C18 （250 mm ×4.6 mm，5 μm）;流動相0.02 mol/L乙酸銨-乙腈（84∶16） ;流速0.5 mL·min-1;柱溫30 ℃;檢測波長245 nm;進樣量10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 三葉青多糖含量測定

2.1.1 檢測波長的選擇

供試品溶液與對照品溶液均在490 nm處有最大吸收，故選擇檢測波長為490 nm。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以濃度為橫坐標(biāo)（C），吸光度為縱坐標(biāo)（A），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程：y=9.268 3x+0.001 3，r=0.999 3。結(jié)果表明，葡萄糖對照品在0.020 5～0.123 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈較好的線性關(guān)系。

2.2 方法學(xué)考察

精密度實驗測定結(jié)果得吸光度均值為0.385，RSD=0.50%。表明該方法精密度良好，符合含量測定要求。穩(wěn)定性試驗測定結(jié)果得RSD=0.49%，表明在顯色后180 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。重復(fù)性試驗測定結(jié)果得RSD=0.85%，表明重復(fù)性良好。加樣回收試驗平均回收率為99.8%，RSD=2.97%，表明方法的準(zhǔn)確性良好，方法可行。結(jié)果列于表1。

2.3 三葉青多糖提取工藝優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗

提取時間2 h時，多糖的提取率達到最高;提取次數(shù)為3次時，多糖的提取率達到最高;料液比為1∶20時，多糖的提取率達到最高;醇沉濃度為80%時，多糖的提取率達到最高。

2.3.2 提取條件優(yōu)化

在單因素試驗基礎(chǔ)上，設(shè)計L9（34）正交試驗（見表2），試驗結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果為差異均不顯著。由結(jié)果可知，各因素影響大小依次為：料液比>提取時間>提取次數(shù)>醇沉濃度;三葉青多糖的最佳提取工藝為A3B1C3D1，即提取時間為2.5 h，提取次數(shù)為2次，料液體積比為1∶25，醇沉濃度為70%。

采用最佳提取工藝條件進行驗證試驗，得多糖提取率為7.40%。

2.4 三葉青多糖的單糖組成

單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖見圖1，三葉青多糖水解液單糖色譜圖見圖2。分析結(jié)果顯示，三葉青多糖由甘露糖（Man）、鼠李糖（Rham）、半乳糖醛酸（GalUA）、葡萄糖醛酸（GlcUA）、氨基葡萄糖（GlcN）、氨基半乳糖（GalN）、葡萄糖（Glc）、阿拉伯糖（Ara）、巖藻糖（Fuc）、半乳糖（Gal）組成。

3 小結(jié)與討論

多糖的提取大多用水浴提取法，包括酸提取法、堿提取法[16]，此外還有超聲波提取法[17]，微波提取法[18]、酶解法等[19]。水浴提取法是多糖提取的最常用方法，該方法反應(yīng)條件溫和，對多糖的結(jié)構(gòu)組成及生理活性破壞較小。本實驗采用水提醇沉法提取三葉青多糖，并通過正交試驗優(yōu)選出最佳提取工藝。饒君鳳等采用離子色譜法測定三葉青塊根和葉中多糖的單糖組成，測得有巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖6種單糖[20]。本實驗通過柱前衍生化HPLC法對三葉青多糖的單糖組成加以分析，結(jié)果表明，除了上述6種單糖外還有半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、氨基葡萄糖、氨基半乳糖這4種單糖，對文獻報道進行了補充。

參考文獻：

[1] 南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典·下冊[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2014：70.

[2] 黃傳貴.天然藥8404種詮釋[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2014：127.

[3] 吳浩，常欣，桑旭峰，等.不同產(chǎn)地三葉青中27種礦質(zhì)元素的綜合評價[J].中成藥，2018，40（11）：2475-2480.

[4] 吳舟濤，朱玲燕，吳學(xué)謙，等.三葉青化學(xué)成分和抗腫瘤作用研究進展[J].中南藥學(xué)，2017，15（3）：319-324.

[5] 廖淑彬，蔡韋煒，陳丹，等.閩產(chǎn)三葉青地上部分提取物體內(nèi)抗炎鎮(zhèn)痛作用研究[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2017，34（3）：319-324.

[6] 蔡韋煒，陳丹，范世明，等.中藥三葉青化學(xué)成分及藥理作用研究進展[J].天津藥學(xué)，2014，26（1）：38-41.

[7] 丁富娟，王悅，李慧芬，等.三葉青實驗研究概述[J].山東中醫(yī)雜志，2017，36（9）：816-818.

[8] 楊王偉，葉俊英，周瑩瑩，等.中藥資源三葉青應(yīng)用基礎(chǔ)研究進展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2012（23）：79-81.

[9] 肖志偉，樂智勇，朱國雪，等.人參多糖檢測方法及提取工藝優(yōu)選[J].中國現(xiàn)代中藥，2016，18（1）：106-109.

[10] 陳小芳，鐘曉明，黃真，等.海芋多糖提取工藝優(yōu)化及其單糖組成分析[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017，41（4）：265-270.

[11] 張立明，樊瑞軍，楊鳳琴.三葉青黃酮誘導(dǎo)SMMC-7721肝癌細胞凋亡的實驗研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2010，21（11）：2850.

[12] 賈玉柱，勞群，祁克信，等.三葉青提取物聯(lián)合介入治療兔VX2肝癌模型多層螺旋CT表現(xiàn)及肝功能動態(tài)分析[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2012，41（4）：56.

[13] 郝變，袁少雄，潘麗麗，等.瓜蔞皮多糖的單糖組成及含量測定方法研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2015，30（6）：2153-2156.

[14] 張海珠，史志婷，王瑩，等.柱前衍生化高效液相色譜分析云南松松塔多糖的單糖組成[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2015，21（24）：30-33.

[15] 王媛媛，張暉，楊俊松，等.柱前衍生化高效液相色譜法分析9種多糖中的單糖組成[J].濟寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2016，39（4）：241-244.

[16] 杜清，許曉輝，林鵬程，等.植物多糖的研究進展及開發(fā)前景[J].轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)電子雜志，2017，4（4）：78-82.

[17] 于侃超，楊曉杰，王瑤，等.不同提取方法對桔梗多糖體外抗氧化性的影響[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2016（28）：251-256.

[18] 陳艾萌，潘潔，胡博，等.川牛膝多糖抗氧化活性測定和微波提取工藝優(yōu)化[J].中成藥，2017，46（1）：80-84.

[19] 陳燕文，胡晶紅，李佳，等.金銀花多糖提取、精制方法和藥理活性綜述[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017，19（1）：155-159.

[20] 饒君鳳，呂偉德，倪承珠，等.離子色譜法測定三葉青多糖中單糖組成[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2016，12（12）：42-44.

（責(zé)任編輯：丁志祥）