基于親脂性陽離子線粒體靶向化合物研究進展

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（1 十堰市人民醫院 湖北醫藥學院附屬人民醫院藥學部，湖北十堰 442000；2 湖北醫藥學院附屬東風醫院 血液風濕科，湖北十堰 442008）

線粒體是細胞生命活動的能量供應工廠，是多種生理生化過程的發生場所，同時，大多數脊椎動物中，細胞凋亡主要由線粒體調節。因此線粒體功能變化，直接影響一系列疾病（如：心腦血管疾病、糖尿病、神經系統疾病等）的產生和發展，尤其與腫瘤凋亡和轉移、關系密切[1-2]。近年來，人們開始關注組織、細胞乃至細胞器相關的精確靶向治療，小分子靶向抗腫瘤藥物已成為抗腫瘤藥物的研發主流，線粒體靶向策略引起了相關研究者高度重視。目前將藥物靶向線粒體的策略和方法主要有三種：離域化的脂溶性陽離子向導(delocalized lipophilic cation, DLC)、線粒體靶向的肽鏈片段(mitochondrial targeting sequence, MTS)以及囊泡載體(vesicle)。本文將著重對離域化的親脂性陽離子（DLC）介導的靶向小分子化合物研究進行綜述。

1 親脂性陽離子（DLC）線粒體跨膜導入機制

線粒體間隙帶有大量正電荷，其基質中帶有大量負電荷，從而形成線粒體內膜的跨膜電位(mitochondrial transmembrane potential, MTP)。MTP內負外正，在機體正常細胞中，其值為-130mV～150mV，當親脂性陽離子在線粒體富集到線粒體膜內外電位平衡的時候，則會在線粒體內聚集[3]。腫瘤細胞的線粒體膜電位往往高于正常細胞[4]，因此，將親脂性陽離子與小分子通過共價鍵直接連接，可僅僅依賴于靜電吸附，不通過復雜的機制穿透線粒體膜，隨后，釋放出的生物活性分子直接在線粒體中發揮作用，誘導腫瘤細胞死亡或凋亡。

親脂性陽離子載體主要包括三苯基膦（TPP）、其衍生物如十八烷基三苯基膦（STPP）、三乙胺鹽、地喹氯胺（Dequalinium chloride，DQA）、消旋－四苯卟吩等[5]。TPP是其中最典型的、應用最廣泛的，TPP末端活潑基團能與藥物連接且保持藥物活性，結構整體由親水性帶電基團和疏水性基團構成，三個苯環π電子云的離域現象使整個分子帶正電荷[6]，由此可在線粒體膜電位的驅動下，攜帶小分子藥物靶向線粒體內部。DQA是一種季銨鹽[7]，結構中有兩個對稱的正電荷中心，由長脂肪鏈連接，能夠穿透脂質雙分子層，能滿足化合物不同位點的多種結合方式。結構如圖1所示。

圖1 親脂性陽離子TPP和DQA的化學結構Figure 1 The structure of compounds TPP and DQA

近年來研究證實，TPP與DQA作為應用廣泛的DLC，用于修飾活性小分子化合物成功地實現線粒體靶向，在一定程度上應用于抗腫瘤藥物靶向于線粒體抑制細胞增殖、抗氧化藥物靶向治療線粒體氧化損傷以及設計出一系列靶向線粒體的熒光探針等，以期達到最佳的治療效果及較低的給藥劑量。當然，若DLC在線粒體中大量聚集，其正電荷可能會導致膜電位的喪失以及影響呼吸鏈電子傳遞[7]，在使用此項策略時也應關注細胞毒性。

2 以TPP為載體的線粒體靶向化合物

首次使用TPP的線粒體靶向偶聯物的研究報道于1995年，Burns J.等[8]設計合成了14C標記的硫醇探針，由三苯基溴化磷（TPP）將其靶向導入線粒體，用來標記蛋白硫醇，從而對線粒體氧化應激過程進行探索。1999年，新西蘭達尼丁Otago大學Smith課題組率先合成靶向線粒體的抗氧劑MitoVite E[9]，并證明了將抗氧劑靶向轉移進入線粒體，可有效阻止線粒體氧化損傷。隨即，輔酶Q10和TPP 的綴合物MitoQ10[10]、SOD輔基模擬物與TPP的綴合物MitoSOD等[11]相繼被研發并證明了其可對組織的氧化應激損傷進行選擇性保護。2017年，張宇睿選天然抗氧化劑迷迭香酸為先導化合物，經TPP修飾得到線粒體靶向迷迭香酸Mito-RA[12]；對NADPH活性基團結構進行剖析，設計合成線粒體靶向二氫吡啶類化合物Mito-N[13]。研究發現迷迭香酸經TPP修飾后，對ROS清除效果和輻射防護效果都得到提高；Mito-N類化合物能通過清除輻照產生的ROS而有效保護CHO-K1或Hela細胞的遺傳物質完整性。化合物結構如圖2所示。

圖2 以TPP為載體的靶向抗氧劑Figure 2 The structure of targeted antioxidants with TPP

線粒體靶向的抗腫瘤藥物分子設計，最直接的方法是通過酰胺鍵、醚鍵、碳磷鍵等將TPP與活性小分子連接。2002年，Fantin等[14]將TPP通過吡啶鎓離子與F16分子合成具有線粒體靶向性和內在熒光的化合物F16-TPP，在線粒體大量聚集，且顯示出了對多種腫瘤細胞的殺傷能力。選擇現有的抗腫瘤藥物進行結構改造，也是靶向藥物設計的重要思路，浙江大學韓旻教授課題組將多柔比星與 TPP 化學連接, 顯示了良好的線粒體靶向作用, 并且通過線粒體途徑誘導了腫瘤細胞的凋亡, 克服腫瘤細胞耐藥性[15]。2018年Lee J H等[16]基于三苯基膦-香豆素探針（TPP-C）的線粒體靶向藥物制劑，制備了由TPP和多柔比星（DOX）修飾的制劑（TPP-C-DOX）。通過線粒體靶向配體TPP介導的線粒體跨膜過程，TPP-C-DOX 被內化于線粒體中。隨后，DOX從線粒體中的TPP-C- DOX 釋放，作用于線粒體DNA（mtDNA），導致腫瘤細胞線粒體功能障礙，最終死亡。青蒿素作為抗瘧藥，近年來對其抗腫瘤作用的研究引起了相關領域的關注，2016年，新加坡國立大學Zhang Chongjing課題組先合成ART-TPP[17]，將ART引導到線粒體中，從而提高ART的活化水平并靶向更多的蛋白質靶標。進一步合成ART-TPP-Alk，通過點擊化學方法連接熒光分子和生物素標簽，由于線粒體是細胞的強大動力，更多線粒體蛋白被ART-TPP-Alk共價修飾。2017年，Noh等[18]報道了一種線粒體靶向光動力治療藥物（MitDt），其結構主體為鹵素原子與吲哚環結合的鹵化物，能良好的被腫瘤細胞攝取并進入線粒體，吸收光能從而將氧轉化為自由基形態導致細胞程序性死亡。以上化合物結構如圖3所示。

圖3 以TPP為載體的靶向抗腫瘤劑Figure 3 The structure of targeted antitumor agents with TPP

綜上所述，TPP修飾的小分子化合物能成功實現線粒體靶向，其應用廣泛，對抗氧劑、抗腫瘤劑的結構改造提供了可靠的思路。并且運用靶向線粒體技術，人們設計并合成了許多特異性的熒光探針，可用于探索研究藥物作用靶點或檢測線粒體內相關指標。此外, 納米載體 (脂質體、樹枝狀大分子等) 與 TPP化學鍵合, 可將包載的小分子藥物靶向到線粒體，逐漸成為了研究的熱點問題。

3 以DQA為載體的線粒體靶向化合物

地喹氯胺（DQA）亦可直接與小分子連接，發揮線粒體靶向作用。2015年，宋彥峰等[19]將阿霉素與地喹氯胺連接合成DQA-DOX， 細胞毒性實驗顯示：與游離DOX相比，DQA-DOX對A549細胞的毒性明顯比游離DOX低，但DQA-DOX對耐DOX細胞MCF-7/ADR細胞的毒性比游離DOX顯著增強。結構如圖4所示。

圖4 化合物DQA-DOX的分子結構Figure 4 The structure of the compound DQA-DOX

但更多的研究表明，DQA形成的囊泡狀聚集體DQAsomes，其具備較高的穩定性，不易沉淀，彼此融合，可聚集在溶液中，仍可穿透磷脂雙分子層進入線粒體，成為可包裹小分子的靶向載體[19-20]。2005年，Chen SM等[21]制備了基于DQA somes修飾的紫杉醇脂質體，將裸鼠接種人結腸癌COLO- 205細胞以產生腫瘤，再將藥物作用于各組小鼠，結果顯示紫杉醇組對腫瘤無明顯抑制，而DQAsomes紫杉醇脂質體組對腫瘤抑制率達50%。Zhang等[22]將抗性調節劑奎納克林與柔紅霉素同時摻入線粒體靶向的DQA脂質體中，研究結果顯示：體外抑制MCF-7干細胞和治療小鼠復發腫瘤方面療效明顯增強，可用于治療和預防由MCF-7癌癥干細胞引起的乳腺癌復發。DQA somes對于藥物的包裹作用，有利于保持藥物原有性狀，同時也可滿足多數無法較好被吸收的藥物，能根據具體需要改變脂質體系統理化性質。Li N等[23]在對白藜蘆醇的研究中，合成了DQA-PEG2000-DSPE脂質體用以包裹白藜蘆醇，將其遞送至線粒體，檢測其對非小細胞肺癌A549細胞或非小細胞肺癌A549耐藥細胞抑制能力，結果顯示白藜蘆醇脂質體在耐藥性和非耐藥性腫瘤細胞中均能誘導細胞凋亡，并隨之釋放細胞色素C，誘導細胞凋亡。

多數研究表明，DQA somes不僅可特異性將藥物分子運送到線粒體中，而且能夠保護分子免于酶的降解，增加細胞對藥物的攝取。例如在與DNA組裝成的脂質體的研究中，DQA somes與模擬胞漿膜的脂質作用時，不能釋放DNA，但與模擬線粒體膜且富含心磷脂的脂質作用時，則可以釋放出DNA[24]。這種策略能更好的使藥物特異性作用于靶點，而降低治療過程中的毒副作用。

4 其他DLC介導的線粒體靶向化合物

近年來對于腫瘤的治療中，光動力療法（PDT）成為一種頗具前景的治療手段，而選擇合適的光敏劑是推進PDT廣泛應用的重要因素。目前有許多關于含有陽離子部分的光敏劑的報道，如銨和吡啶鎓，并且發現一些光敏劑具有線粒體靶向能力。2017年Taba等[25]設計了新型的原卟啉IX衍生物PPIX-1和PPIX-2，分別束縛了4個和8個胺部分，實現線粒體靶向聚集，發現這些分子在660nm激光照射后表現出優異的單線態氧量子產率，并且具有非常好的水溶性，較外源性PPIX有更強的體外PDT功效。結構如圖5所示。

圖5 化合物PPIX-1和PPIX-2的分子結構Figure 5 The structure of the compounds PPIX-1 and PPIX-2

四苯基卟啉衍生物也是廣泛用于PDT的系列化合物，Hammerer等在對此系列化合物進行研究中發現，它們表現出高單線態氧量子產率以及高雙光子吸收區，但細胞內化非常差。其課題組于2018年報道了卟啉-三苯胺雜化系列的新光敏劑，其引入基團乙烯基吡啶鎓三苯胺（TP）帶有陽離子電荷，合成新的衍生物PTEG(TP)2，使水溶性大大增強的同時，具有線粒體靶向性[26]。新系列化合物的理化性質改進與其特定的線粒體定位能力相結合，顯著提高了雙光子激活光動力的治療效率。

2018年，Mingxing Hu等[27]提出了一種新的可溶性線粒體靶向性烷化劑HMX-1，在細胞水平上具有優異的線粒體靶向能力，其在低氧條件下偶氮鍵被選擇性地還原，苯胺氮芥（核DNA烷化劑）被釋放，同時伴隨熒光顯著增加，證明前藥的活化。在四種人癌細胞系（惡性黑素瘤A375，乳腺癌MDA-MB-231，肺癌A549和前列腺癌DU145）和正常人結腸中進行MTT測定，以評估HMX-1的抗癌活性，常氧條件下HMX-1的細胞毒性高于缺氧條件，且在常氧和缺氧條件下對NCM-460分別比A375細胞的IC50值高出344%和228%。HMX-1體內活化機制如圖6所示。

圖6 化合物HMX-1的體內活化機制Figure 6 The in vivo activation mechanism of compound HMX-1

5 結語

線粒體靶向制劑提高腫瘤治療精準性，降低對正常細胞的毒副作用，在目前的研究中，取得了許多積極的成果。本課題組亦將選擇黃芩苷和茶多酚等作為先導化合物，選擇性在結構中羥基結合位點接入TPP基團，使其具有線粒體靶向性。對目標化合物進行體外的抗氧化活性驗證檢測，再與腫瘤細胞共孵育，對細胞內活性氧水平進行檢測以及研究腫瘤細胞的增殖、遷移和凋亡狀態。除此以外，利用親脂性陽離子線粒體靶向性，設計熒光探針，對線粒體活動相關指標或藥物作用靶點探尋也是目前研究中可應用的重點方法之一。

親脂性陽離子在小分子線粒體靶向化合物設計合成的領域中，展示出了其獨特的優勢和潛力，不僅能穿透線粒體膜，精確將藥物分子帶入線粒體基質中，且與藥物分子結合可改變藥物理化性質等。但其仍存在一些需要探討和解決的問題：（1）TPP與藥物活性基團結合；以綴合物形式存在細胞中，可能影響藥物的療效；（2）高濃度陽離子會使線粒體膜電位去極化而危及細胞生存；（3）盡管TPP具有良好的線粒體靶向活性，但其正電荷可能限制其使用，因為許多帶負電荷的血液成分可能導致與TPP的治療系統形成非特異性聚集體而失去作用。因此，基于現有基礎研究，針對不同疾病生理生化狀態，利用化學生物學技術進行針對性研究，優化線粒體靶向制劑。