耐鹽細菌研究進展及多樣性分析

詹建立，易霞

（1.喀什大學 生命與地理科學學院，新疆 喀什 844000；2.九江學院 基礎醫學院，江西 九江 332005）

耐鹽細菌（B.halodurans）是指對2.5 mol/L 以上濃度氯化鈉有特殊適應能力的細菌.它主要生活在鹽湖、鹽堿湖、海水、廢水、鹽堿地、活性污泥、腌制食品中.由于長期生活在極端環境下，菌體細胞內形成多種具有特殊功能的酶以適應環境，進而在物種、基因和生理代謝等方面存在多樣性.

國外對耐鹽菌的研究起步較早.Arreola R[1]等對耐鹽芽孢桿菌的轉錄因子PyrR 進行了初步研究；Anbu Rajan L[2]等對四氫嘧啶的生物合成基因的進化關系和異源表達進行了研究；楊重[3]等從基因層面對2種耐鉻鹽還原菌Staphylococcus sp.YZ-1 和Bacillus cereusCC-1 的Cr（Ⅵ）脫毒特性與機理差異進行了研究；曹凱[4]等對浙江舟山鹽場來源的耐鹽菌（Bacillussp.CK-1）蛋白酶的酶學特性進行了研究，結果顯示該菌分泌的蛋白酶活性隨著NaCl 濃度的變化呈現先增大后減小的趨勢.本文主要對B.haloduransC-125，MIR32，DSM497，XJU-1，XJU-80 等亞種在物種進化、代謝生理、遺傳和生物多樣性等方面進行歸納，并分析該屬種存在種間多樣性的可能原因.

耐鹽菌研究主要集中在菌株的分離鑒定、功能菌株的開發利用、酶學、有機物的降解和去除、發酵性能、植物促生特性、有毒物質的脫毒機理等領域.耐鹽菌作為極端微生物，在細胞內形成多種具有特殊功能的酶以適應環境.因此，酶資源的研究和開發一直是該菌株研究的熱點.Nquyen T T[5]等探討了耐鹽芽孢桿菌Bh0493 的催化功能；耐鹽芽孢桿菌C-125 的Bh0225 的一種未知功能的酶編碼基因已經成功克隆.Hong Y H[6]等對耐鹽芽孢桿菌AI 品系依賴于金屬的超嗜熱的L-阿拉伯糖異構酶進行了同源重組.Agarwal R[7]等還對L-核酮糖激酶的底物多樣性進行了初步思考.木聚糖酶、漆酶和角蛋白酶的研究也有開展[8-10].當然，耐鹽芽孢桿菌的耐鹽機制仍需深入探討.

2 耐鹽細菌研究進展

我國學者在功能菌株的開發利用方面也有大量研究.閆紅梅[11]從環氧樹脂廢水中分離得到產堿菌、假單胞菌、芽孢桿菌3 株耐鹽菌株，對其降解特性進行了研究；宋郭柳[12]等利用菌株分離、電鏡觀察和DNA擴增技術從深圳填海區植物根際土壤中篩選鑒定了3 株耐鹽菌，并對其碳利用能力進行了分析；陳遠哲[13]等研究了金華火腿來源的耐鹽菌（Staphylococcus equorum）發酵對咸鴨蛋蛋清脫鹽及抗氧化活性的影響；孫曉瑩[14]等對鹽堿地植物根際土壤來源的耐鹽菌（Pseudomonas brassicacearumYZX4）的植物促生特性進行了研究；陳弘昊[15]等對3 株耐鹽細菌（S1Microbacterium sp，G12Zhihengliuella sp，Y3Pseudomon putida）對多環芳烴降解性能進行了研究.

2.1 菌株分離鑒定

迄今為止，已分離鑒定的B.halodurans有很多，典型種如B.haloduransC-125（JCM9153，AB002661），MIR32（AY017348），DSM8718（X76442），DSM497（AJ302709），AH-101（JCM9161，AB027713），XJU-1（CGMCC 1.4010，AY856453），XJU-80（CGMCC 1.4011，AY856452）等.B.haloduransC-125 分離于1977年[16]，Horikoshi 先后報道了其分泌產生的β-半乳糖苷酶和木聚糖酶[17-18].B.haloduransC-125（JCM9153，AB002661）是繼B.subtilis之后的又一株全基因測序的Bacillus，目前已經推測其有4 066 個編碼蛋白.MIR32（AY017348）于1995 年由Breccia 分離于阿根廷[19].2002 年，M Alejandra Martinez[20]等通過16S rRNA 序列分析、16S-23S rRNA PCR 指紋、tDNA 間區分析和質粒轉化實驗將MIR32 鑒定為B.halodurans.DSM8718于1993 年分離于德國，于1994 年初步將其鑒定為B.halodurans[21].AH-101（JCM9161，AB027713）由Takami 于1989 年分離于日本，最初將其鑒定為能夠產耐熱角蛋白酶的芽孢桿菌（Bacillus）[22].1999 年Takami等又進一步將AH-101 鑒定為B.halodurans[23].DSM497（AJ302709）于2000 年由Swiderski 分離于德國.B.haloduransXJU-1 和B.haloduransXJU-80 是國內報道的又一株耐鹽芽孢桿菌[24]，與南美（阿根廷）、亞洲（日本）和歐洲（俄羅斯）等地分離到的B.halodurans種進行了研究.B.haloduransAlk36 是一株嗜堿（pH7.5）耐熱的G+細菌，其嘌呤核苷磷酸化酶也得以克隆和純化[25-26].這些研究對闡明B.halodurans屬內種的遺傳多樣性具有重要意義.

2.2 多樣性研究

2.2.1 物種多樣性B.haloduran有很多亞種，如C-125，MIR32，AH-101，DSM497，DSM8718，ALK36.這些種在地理分布上存在差異.XJU-1 和XJU-80 同是分離于中國吐魯番水泥廠的污水中，但是基于16S rRNA序列分析不在同一分支上，前者與分離于日本的C-125 在同一分支上，后者與分離于德國的DSM497在同一分支上.同時是分離自日本的C-125 和AH-101 不在同一分支上，同是分離于德國DSM8718和DSM497也不在同一分支上.可以推斷同屬一物種即便是在同一自然環境下，也可以演化為不同的亞種.相同因素脅迫下，微生物的進化也是多樣性的（見圖1）.

2.2.2 生理代謝多樣性B.haloduransC-125，MIR32，AH-101，XJU-80，XJU-1 在形態和生理生化方面表現出屬內的諸多共性，如G+、棒狀細胞、孢子大多橢圓且多膨脹、好氧生長、水解淀粉、液化凝膠.但是這些菌株在表型上呈現出生理和代謝的多樣性（見表1）.如細胞大小不一，孢子形狀和膨脹部分不同（如卵形和輕微膨脹），生長的溫度和pH 范圍有差異，NaCl 耐受程度不同，吐溫降解有差異.這些生理和代謝的多樣性很可能源于菌種生活環境的不同.因為不同生活環境給微生物細胞的脅迫不同，為了適應環境，同一種的細胞可能會進行不同的代謝，進而有了不同的產物.

圖1 B.halodurans 菌株進化樹

表1 B.halodurans 菌株的形態和生理生化特征

2.2.3 基因多樣性（1）16S rRNA 序列.16S rRNA 基因的很多特點有利于進行生物進化和系統分類研究，如其普遍存在于原核生物細胞，信息恒定，含量較高且易提取，分子量適中.因此，在B.haloduran種的分類也采用16S rRNA 基因.圖1 說明B.haloduran種內各菌株間分子進化關系的同時，也存在16S rRNA序列的多樣性.分離于新疆吐魯番的菌株XJU-1 和XJU-80 在進化上并不在同一分支上，而與分離自日本的C-125 和分離自德國的DSM497處于同一分支上，這說明相同生境下的菌株存在基因序列的多樣性.

（2）CG 含量分析（見表2）.CG 含量是目前發現微生物新種所必需的指標之一.B.haloduransCG含量的平均值為43.7%，44.5%，44.1%，42.2%，40.5%，43%.所選6 種菌株（C-125，AH-101），DSM497，（XJU-1，XJU-80），MIR32 分別分離于日本、德國、中國，阿根廷，在地理環境上有顯著的差異，在物種進化和遺傳多樣性方面也有代表性.部分B.halodurans菌株的CG 含量不在此范圍，如DSM49（744.5 mol%）和XJU-80（40.5 mol%）.這就體現出B.halodurans在種上的多樣性.據測定CG 比相差低于2%時，沒有分類學上的意義；種內各菌株間的（C+C）mol%含量差別可在2.5%～4.0%之間，若相差在5%以上時，就可以認為屬于不同種，假如差距超過10%，一般就認為是不同屬.

表2 B.halodurans 菌株16S rRNA 和CG 含量

（3）DNA-DNA 同源性雜交（見表3）.物種DNA 堿基的排列順序是長期進化的歷史在分子水平上的紀錄，DNA-DNA 同源性雜交是更精確的遺傳性狀指標.親緣關系越近的微生物，其堿基序列也越接近，反之亦然.一般認為，若兩菌間CG 比相差1%，則堿基序列的共同區域就約減少9%；若CG 比相差10%以上，則兩者的共同序列就極少[12]62-67.若有一群CG 比范圍在5%以內的菌株，要鑒定它們是否屬同一個物種，就必須通過DNA-DNA 間的分子雜交.

表3 B.halodurans 菌株DNA-DNA 同源性雜交

由表2 和表3 可見，CG 比范圍在5%以內的C-125，XJU-1，XJU-80，DSM497菌株，在DNA-DNA 同源性雜交結果上顯示明顯的差異性.

3 討論

3.1 多方面綜合考慮微生物譜系分析

在生態環境中，由于環境因子的組成和影響條件不同，各個生境中的微生物類群的分布和組成就有所不同，B.halodurans物種的多樣性印證了這一點.即便是在相同的生境中，同一物種下不同亞種的16S rRNA序列分析也會有很大的差異，如XJU-1，XJU-80 同是分離于中國吐魯番水泥廠的污水中，16S rRNA 序列分析卻不在同一分支上.因此，對微生物的譜系分析應該從基因遺傳、生理和生態等各方面綜合考慮.

3.2 基因改變背景下的環境脅迫是種間多樣性的原因

B.halodurans種內，不同亞種在形態和生理生化方面表現出諸多共同特征，列舉的幾種B.halodurans亞種在革蘭氏反應、細胞形狀、好氧生長、生長溫度、水解淀粉、凝膠液化、乙酸利用、氧化酶、木聚糖方面差異很小（見表1）.說明這幾種微生物在細胞壁的結構、對溫度的適應、代謝類型、次生產物等方面有共性，它們可能存在乙醛酸途徑來獲取能量和營養.因此，環境脅迫對于生理代謝的影響和基因相比顯得更為直接，但遺傳基因改變才是環境影響的背景因素，也是種間多樣性的可能原因.

4 展望

作為極端微生物，耐鹽菌研究主要集中在菌株的分離鑒定，功能菌株的開發利用、酶學、有機物的降解和去除、發酵性能、植物促生特性、有毒物質的脫毒機理等方面.利用極端環境脅迫下耐鹽菌不同亞種在形態和生理生化方面表現出來的特性，進行功能菌株的篩選、改良，并建立功能菌株庫，這應該是耐鹽菌今后研究的主要趨勢.隨著經濟的迅速發展，環境保護也愈顯迫切.因此，能夠分解有機物、凈化污水的功能菌株應用會更加廣泛.