植物在高溫脅迫下的蛋白質組學研究進展

許英旭，沙偉，張梅娟，馬天意

（齊齊哈爾大學 1.生命科學與農林學院，2.抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

植物在生長發育過程中會受到許多不利于生長的生物脅迫因子和非生物脅迫因子的影響，如高溫、干旱、凍害、鹽堿、冷害、水澇、環境污染、病菌、病蟲侵害等，而溫度是一種非常重要的非生物脅迫因素，對植物的生長發育具有重要的影響[1].在熱脅迫條件下，所有生物體都會產生熱休克反應，并對溫度上升作出反應.每種植物的生長發育都有特定的溫度需求，一般植物生長溫度大約在0～44 ℃，其溫度的敏感度與其起源地有緊密的聯系[2].在持續惡化的情況下，深入了解植物抗逆反應機制，為今后的植物生長發育提供重要的理論基礎和指導意義.

高溫脅迫對植物的損害主要是通過使細胞中的蛋白質變性和失活，減緩或停止生化反應，停止生長和發育，甚至死亡[3].高溫脅迫會增強植物的蒸騰作用，使水分流失過多，為了減小蒸騰，植物葉片氣孔關閉，導致CO2攝入量減少，由于CO2是植物光合作用所必需的，高溫脅迫會因此影響光合作用，即有機物的積累[4].植物體內的各種生理生化反應都是由酶催化的，高溫脅迫會影響酶的活性，從而影響植物生長代謝[5].

本文對高溫脅迫下幼苗期植物和成苗期植物的蛋白質組學進行綜述，深入了解高溫脅迫下植物的基因表達調控機制，植物對高溫脅迫的響應機制，對提高作物抗性，培育耐高溫新品種具有重要意義，也為今后植物在高溫脅迫下的蛋白質組學研究提供理論基礎和重要依據.

1 高溫脅迫下幼苗期植物的蛋白質組學分析

Han[6]等在35，40，45 ℃條件下分別對7 日齡水稻（Oryza sativa）幼苗處理48 h，并檢測其葉片的蛋白質組，發現在35～45 ℃時，連接木質化相關蛋白和1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶表達下調，而保護蛋白表達顯著上調.不同的高溫會誘導植物采取不同的適應策略，保護機制主要是使植物維持光合作用能力.當溫度上升到40 ℃或更高時，一些抗氧化途徑被激活；當遇到45 ℃的高溫時，各種熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）均被誘導表達，與熱休克蛋白相關的保護機制被激活.可以看出，隨著環境溫度的升高，植物會調用越來越多的保護機制參與和維持機體正常的生理代謝.

Mohammadi[7]等將發芽2 日齡油菜（Brassica campestris）幼苗分別置于較高的溫度（白天45 ℃，晚上34 ℃）脅迫和對照條件（白天22 ℃，晚上18 ℃）下，在生長室中進行16 h/8 h（光照/黑暗）的光周期，相對濕度為65%～70%，持續12 h.通過雙向電泳（Two-dimensional electrophoresis，2-DE）進行分離，鑒定出381 個蛋白質點，其中58 個蛋白質在高溫脅迫下發生了顯著變化，27 個和31 個蛋白質分別顯著下調和上調，超過30%的已鑒定蛋白質屬于葉綠體，大多數剩余的蛋白質被預測定位在細胞質中.通過統計分析表明，高溫脅迫對蛋白質表達水平有重要影響，參與細胞運輸、能量和代謝的蛋白質的上調，以及參與疾病、防御、蛋白質合成和信號轉導的一些蛋白質的下調可能是高溫脅迫下生理和形態反應的主要原因.在油菜下胚軸中觀察到的抗壞血酸過氧化物酶蛋白和基因表達水平對高溫脅迫反應的增加表明，抗壞血酸過氧化物酶是一種短期高溫脅迫反應蛋白，該研究結果還表明，熱脅迫下參與能量和代謝的蛋白質的上調可以利用油菜幼苗的大部分營養儲備，這可能是熱脅迫條件下油菜生長減緩的原因.

2 高溫脅迫下成苗期植物的蛋白質組學分析

2.1 高溫脅迫下糧食作物的蛋白質組學分析

Smruti Das[8]等使水稻（cv.N22）在開花期經受28 ℃/18 ℃（對照）和42 ℃/32 ℃（高溫脅迫）處理后檢測葉片蛋白質組.在對照和受脅迫的葉片中，大約存在111 個共同的蛋白質點，其中37 個上調，15個下調，另外還有59 個未鑒定出的蛋白質點，成對蛋白質點的體積呈線性分布.從受高溫脅迫的葉蛋白質組中，通過MALDI-TOF MS 分析鑒定，186 個蛋白質獨特點中有30 個具有參與光合作用、解毒、能量代謝和蛋白質生物合成的主要功能.在生長室條件下，當水稻在42 ℃的溫度下處理24 h 時，發現一組低分子量小熱休克蛋白（sHSPs）是由水稻葉片中的高溫脅迫誘導的，水稻葉綠體sHSP 在大腸桿菌（Escherichiacoli）中表達賦予了大腸桿菌對熱脅迫和氧化應激更好的耐受性，即sHSP 在植物獲得的壓力耐受性中發揮重要作用；氧化還原穩態在脅迫條件下，易于產生活性氧（reactive oxygen species，ROS），其作為應激反應的信號分子會對細胞成分造成傷害.同時，受脅迫的葉蛋白質組揭示了幾種新合成的糖酵解蛋白[9].

據報道，在一定范圍內氣溫每升高1 ℃，小麥（Triticum aestivum）產量就會減少4%[10].高溫導致膜滲透性和穩定性改變[11-12]，以及由熱誘導的細胞膜滲漏導致的電解質流失均被認為是嚴重細胞損傷的一種測量方法[13-14].高溫脅迫加速了分子在膜上的動能和運動，從而使生物膜分子內的化學鍵松動，這使得生物膜的脂雙層通過蛋白質變性或不飽和脂肪酸的增加而變得更具流動性[15].Kumar[16]等對乳熟期小麥品種HD2985 分別進行22 ℃（對照）和42 ℃（熱激）處理2 h，并對葉片樣品進行熱響應蛋白鑒定.使用Orbitrap質譜，分別鑒定了47 和38 個獨特的蛋白質點，其中19 個在對照和熱脅迫處理的樣品中有差異表達，差異表達蛋白質包括熱休克蛋白70、氧釋放增強蛋白、鈣調蛋白、應激預測蛋白、茜草素、茜草素活化酶等.使用第二代蛋白質組學工具-軌道芯片鑒定差異表達的多肽，可以在對照和熱激處理的樣品中觀察到97 和262 個多肽.分析顯示，對照組、高溫脅迫處理組和2 個樣品中分別有25，190，72 個多肽，使用軌道阱（無標記）分析，在擬南芥（Arabidopsisthaliana）蛋白質數據庫進行檢索，在對照組中檢索到97 個多肽和60 個蛋白質；在熱激處理組中鑒定到262 個多肽和135 個蛋白質；類似地，使用水稻蛋白質數據庫鑒定了317 個多肽、164 個蛋白質（對照）和592 個多肽、263 個蛋白質接入組，所鑒定到的蛋白質大多數被認為是應激相關蛋白，如熱休克蛋白70、三磷酸腺苷合酶、茜草小亞基等，這些蛋白質參與各種生物途徑，如碳水化合物代謝、信號傳導途徑、脂質代謝等.

2.2 高溫脅迫下蔬菜作物的蛋白質組學分析

Huang W[17]等使用蛋白質組學方法分析了不同溫度處理（4，25，38 ℃）下芹菜葉的蛋白質，共鑒定出71 種蛋白質，被分為14 個功能類，包括光合作用、碳水化合物代謝、氨基酸代謝、蛋白質代謝、信號轉導和能量代謝等.在高溫脅迫下，芹菜（Apiumgraveolens）葉中近一半蛋白質下調表達.鑒定的蛋白質還參與許多代謝途徑，如光合作用、氨基酸代謝、蛋白質代謝、碳水化合物代謝和能量代謝，這些代謝途徑對非溫度響應網絡有重要影響；這些蛋白質可能相互作用，在冷或熱脅迫下在芹菜葉片中建立溫度脅迫響應網絡.

Wang Y[18]等對2 種龍須菜（Gracilarialemaneiformis）株系981 和07-2 在3 個溫度（25，30，35℃）下培養48 h，對2 種株系在熱處理下的生理參數進行分析.結果表明，隨著溫度的升高，2 種株系的比生長速率和光化學效率均降低.實驗發現，株系981 中的藻膽蛋白和可溶性蛋白質濃度在35 ℃下降低；株系07-2 中的藻膽蛋白和可溶性蛋白質濃度表現出初始降低，然后在高溫處理（25，30，35 ℃）下恢復.使用雙向電泳進行2 種株系在35 ℃下的蛋白質組學分析，鑒定了13 種蛋白質，并將這些蛋白質根據功能分為8 類，包括光合作用、能量代謝、蛋白質折疊催化、轉錄、分子伴侶和未知功能.熱休克蛋白和親環蛋白樣蛋白通過雙向電泳鑒定為在35 ℃熱應激下2 種株系中的熱響應蛋白，并發現胞質型HSP70 蛋白在蛋白質折疊中作為分子伴侶發揮關鍵作用，并有助于改善由熱脅迫引起的損傷，從而保持細胞穩態；HSP82蛋白可能在熱應激下對龍須菜的保護起到支持作用，該研究認為這種胞質型熱休克蛋白在改善熱脅迫引起的損傷方面起到重要作用.

高溫脅迫直接導致蛋白質變性、聚集和膜脂流動性增加，但也間接導致葉綠體和線粒體中酶的失活，蛋白質合成和降解的抑制以及膜完整性的損害[19-20].因此，更好地理解植物的耐熱機制對培育耐熱作物至關重要.為了抵消高溫脅迫的有害影響，植物通過改變基因表達、蛋白質合成和翻譯后修飾采用了多種脅迫耐受策略，這有助于在高溫下重建植物生存的細胞穩態[19]3.文獻[21]對菠菜（Spinacia oleracea）同源自交系Sp75 進行了高溫（37 ℃/32 ℃，光照/黑暗）處理，然后收集完全展開的真葉，對其進行蛋白質組學分析，發現高溫脅迫處理菠菜葉片，脯氨酸、可溶性糖、丙二醛和電解液相對泄漏含量均增加，表明高溫脅迫下菠菜葉片的膜完整性喪失.使用基于iTRAQ 的定量蛋白質組學方法分析了菠菜葉中的熱應激反應蛋白豐度模式，共鑒定出葉中的2 205 種蛋白質，其中911 個被定義為高溫脅迫響應蛋白，這些蛋白質在清除活性氧、脂質信號、鈣信號傳遞、磷酸化級聯和14-3-3 介導的信號通路等途徑中發揮重要作用.每組中的大多數高溫脅迫反應蛋白都增加了熱應激，包括轉錄、蛋白質合成、蛋白質加工和蛋白質降解，這表明基因表達和蛋白質周轉在對高溫脅迫的反應中得到增強.雖然光合作用受到抑制，但不同的初級和次級代謝途徑被用于防御熱應激，如糖酵解、戊糖磷酸途徑、氨基酸代謝、脂肪酸代謝、核苷酸代謝、維生素代謝和類異戊二烯生物合成，這些數據構成了菠菜對熱應激反應的代謝圖譜，有助于進一步研究植物熱適應的復雜分子機制，并為菠菜分子育種計劃提供信息.

2.3 高溫脅迫模式下植物的蛋白質組學分析

Rocco[22]等將擬南芥蓮座葉分別在黑暗中于冷脅迫（4 ℃）和高溫脅迫（42 ℃）處理后，進行蛋白質組學分析，2 種溫度處理下都改變了擬南芥蓮座葉細胞膜離子滲透性.共檢測到38 個蛋白質點，豐度隨冷或熱脅迫而變化，2 種溫度處理都影響25 個蛋白質的表達水平.分析表明，擬南芥短期低溫處理對植物光合作用的特定過程有顯著影響，導致了參與電子運輸/能量產生和碳代謝反應的蛋白質的數量增加，或者至少是它們的特定同種型的數量增加.擬南芥幼苗的短期高溫脅迫處理也影響參與光合電子傳遞和碳代謝的葉蛋白豐度，表明高溫脅迫對糖酵解產生負面影響.

3 植物響應高溫脅迫下蛋白質組學存在的問題

近年來，植物蛋白質組學的研究方法并沒有受到很大的束縛，它為解釋植物繁殖發育過程中關鍵事件對外界環境因素響應的分子機制提供了新的蛋白質組學證據.但是，與酵母和動物蛋白質組學的快速發現相比，植物蛋白質組學的進展相對緩慢，主要表現在4 個方面：

（1）受基因組背景和跨物種蛋白質鑒定技術的限制，研究對象仍主要集中在苜蓿（Medicago Sativa）、菠菜[21]1-22、擬南芥[22]1257-1267、小麥[15-16，23]、大麥（Hordeum vulgare）[24]、水稻[6，8，25]、大豆（Glycine max）[26]等幾個有限的品種；

（2）更多的研究集中于環境脅迫下差異表達的蛋白質，而對蛋白質翻譯后修飾和蛋白質-蛋白質相互作用研究較少；

（3）在基于2-DE 凝膠分析差異表達蛋白的表達豐度時，缺乏嚴謹多樣的統計分析，甚至基于2DE-MS技術的整體策略也缺乏標準的實驗設計、數據處理以及分析方案，使得比較不同研究小組報告的結果變得困難.

此外，我國植物蛋白質組學研究隊伍分散，技術平臺薄弱.與快速發展的人類蛋白質組學相比，我國的植物蛋白質組學研究相對落后.植物蛋白質組學未來的發展方向仍是精確定量蛋白質組學技術的廣泛應用和蛋白質翻譯后修飾的深入研究.

4 植物在高溫脅迫下蛋白質組學未來的發展方向

植物對高溫脅迫下蛋白質組學的響應是一個非常復雜的系統，涉及信號轉導、基因調控、蛋白質修飾和代謝調控等一系列細胞途徑.在未來的研究發展中，重點應放在3 個方面：

（1）建立蛋白質調控網絡，全面觀察植物對高溫脅迫的響應，深入研究信號調控.

（2）重點研究蛋白質翻譯后修飾.有證據表明，不同的翻譯后修飾對高溫脅迫響應具有重要影響.

（3）從研究蛋白質相互作用的總體策略出發，充分利用酵母單雜交、酵母雙雜交和其它新技術手段，為細胞的信號傳遞和蛋白質相互作用提供更直接的證據.

綜上所述，植物高溫脅迫下蛋白質組學正處于發展階段，隨著科技創新和技術進步，會有更多與植物響應高溫脅迫相關的蛋白或基因被挖掘，對提高作物抗性，培育耐高溫新品種具有重要意義，為植物抗逆研究提供了理論基礎和依據.