正交試驗法優選柴黃清胰活血顆粒水提工藝*

李 靜，趙 劍，李 志，蒲清榮，羅 群，任桂林

（西南醫科大學附屬中醫醫院，四川 瀘州 646000）

柴黃清胰活血顆粒為西南醫科大學附屬中醫醫院李志教授多年臨床經驗方，由生大黃、延胡索、柴胡、梔子、丹參、黃芩、白芍等14 味中藥組方，具有清熱解毒、活血消腫、通腑泄熱、理氣止痛的功效，用于治療急性胰腺炎。將方中君藥大黃打粉，制粒時作母核使用；柴胡、梔子、黃芪、白芍等中藥材所含有效成分均溶于水[1-2]，故采用水煎煮提取。梔子的主要成分為梔子苷，有消退黃疸、降低丙氨酸氨基轉移酶、保護肝功能，降壓、防止動脈硬化、保護血管內皮細胞等作用，故梔子苷含量常作為評價梔子藥材質量的重要指標[3-6]。本研究中采用L9（34）正交試驗法，以梔子苷的轉移率為評價指標，優選柴黃清胰活血顆粒最佳水提工藝。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；QP-01 型真空泵（天津奧特賽恩儀器有限公司）；JPGT0328 型全數字超聲波發生器（武漢嘉鵬電子有限公司）；NRB17S3W 型電冰箱（日本松下公司）；HH 型數顯電熱恒溫水浴箱（江蘇金壇金城國勝實驗儀器廠）；ZK072 型電熱真空干燥箱（上海實驗儀器廠）；AUW120D 型電子天平（日本島津公司，精度為十萬分之一）。

1.2 試藥

梔子苷對照品（批號為110721-200912，中國食品藥品檢定研究院）；柴胡、延胡索、丹參、黃芩、白芍、梔子等13 味中藥均購于瀘州市寶光中藥飲片有限公司，經瀘州市藥檢所中藥室袁常珍主任鑒定為正品，均符合2015 年版《中國藥典（一部）》規定；柴黃清胰活血顆粒（西南醫科大學附屬中醫醫院制劑室自制）；水為娃哈哈純凈水；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 梔子苷含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；檢測波長：238 nm；進樣量：10μL；流速：1 mL/min；柱溫：40 ℃；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（15 ∶85，V/ V），二元高壓等度洗脫。

2.1.2 溶液制備

對照品溶液：取梔子苷對照品約21 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品貯備液。

供試品溶液：取正交試驗所得干浸膏0.5 g，精密稱定，置磨口具塞錐形瓶中，分別加入稀乙醇25 mL，密閉，再精密稱定，超聲30 min，放至室溫，用稀乙醇補足減失的質量，搖勻，經0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

陰性對照品溶液：準確稱取處方量中藥飲片（不含梔子）適量，制備陰性對照樣品，按供試品溶液制備方法制備不含梔子苷的陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學考察

專屬性試驗：精密量取2.2.2 項下3 種溶液各10 μL，按擬訂色譜條件依法進樣。結果理論板數按梔子苷計應不低于3 000[6]，陰性對照無干擾，詳見圖1。

線性關系考察：精密量取2.2.2 項下對照品貯備液0.1，0.2，0.5，1.0 mL，分別置10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，備用。分別精密量取上述溶液及對照品貯備液10 μL 注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件進樣測定，以峰面積（Y）對質量濃度（X，mg/mL）進行線性回歸，得回歸方程Y=1 583 757.470 7X-9 535.213 1，R2=0.999 7（n=5）。結果表明，梔子苷質量濃度在2.1 ～2 100 μg/mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

檢測限與定量限測定：取梔子苷含量為2.1 μg/mL的對照品溶液，稀釋成質量濃度為0.052 5，0.005 25，0.002 625 μg/mL 的溶液，分別進樣。當信噪比（S/ N）為3 倍基線和10 倍基線噪聲時確定得檢測限和定量限分別為0.002 625，0.008 4 μg/mL。

圖1 高效液相色譜圖

精密度試驗：精密量取梔子苷對照品溶液10 μL，按擬訂色譜條件進樣測定5 次，記錄峰面積。結果的RSD為0.50%（n=5），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10，12，18，24，36 h 時按擬訂色譜條件分別進樣各10 μL，記錄峰面積。結果的RSD為1.56%（n=10），表明供試品溶液在36 h 內穩定。

重復性試驗：取同一批樣品，依法制備供試品溶液6 份，按擬訂色譜條件進樣測定梔子苷的峰面積。結果的RSD為0.63%（n=6），表明該方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密稱取正交試驗的2 號試驗條件所得的2 號浸膏0.1 g，分別按其含量的50%，100%，150%精密加入對照品溶液，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定峰面積，計算回收率。結果見表1。

表1 梔子苷加樣回收試驗結果（n=9）

2.2 正交試驗設計

2.2.1 因素水平設計

黃芩、柴胡、白芍、梔子、丹參、延胡索等13 味中藥醇提后藥渣采用加水煎煮法提取有效成分，以加水量（因素A）、浸泡時間（因素B）、煎煮時間（因素C）、煎煮次數（因素D）為考察因素，按L9（34）正交試驗法進行試驗，以梔子苷的轉移率[7-8]為評價指標，優選最佳水提工藝條件，因素水平表見表2。按處方中白芍、柴胡、黃芩、延胡索、梔子、丹參等中藥飲片的配比，準確稱取9份，每份305 g，按表2 中提取工藝條件組合加水進行煎煮，濾過，合并煎煮液，減壓濃縮至適量，60 ℃恒溫干燥成干浸膏，稱定質量，備用。

表2 正交試驗因素水平表

2.2.2 正交試驗結果

藥材干浸膏質量及梔子苷轉移率結果見表3。正交試驗方差分析結果見表4。可見，各因素對柴黃清胰活血顆粒水提工藝的影響順序為D ＞A ＞C ＞B（煎煮次數＞加水量＞煎煮時間＞浸泡時間）。由于因素B 的極差與離差平方和最小，因此在方差分析中以其作為誤差項，由表3 可見，因素A 和因素C 具有極顯著性差異。結合大生產的角度考慮，確定其最佳提取工藝為A2B1C1D3，即加10 倍量水，浸泡30 min，煎煮3 次，每次1.0 h。

2.3 最佳工藝驗證

按處方量稱取中藥飲片3 份，按優選的最佳工藝進行提取，測定干浸膏質量及梔子苷轉移率。結果干浸膏質量分別為56.375，58.237，58.611 g，梔子苷轉移率分別為57.855%，58.653%，58.816%。可見，該工藝條件可行，簡便，穩定，重復性好。

表3 L9（34）正交試驗結果

表4 梔子苷轉移率方差分析結果

3 討論

因處方中君藥生大黃將打粉，制粒時作母核使用，在水提工藝中不考慮將大黃作為考察指標；考慮選用臣藥柴胡中的有效成分柴胡皂苷a、d 作為考察指標，但由于柴胡皂苷a、d 在煎煮過程中均已發生轉化[9-11]，故在試驗中未檢測到柴胡皂苷a、d 吸收峰。且2015 年版《中國藥典（一部）》收錄的以柴胡為君藥的所有中成藥均未選用柴胡作為考察指標，故本研究中選用質量較穩定的梔子苷作為考察指標。采用高效液相色譜法測定浸膏中梔子苷含量，分離效果較好，操作簡便，穩定可靠。

由于L9（34）試驗中9 個試驗的出膏率不一樣，采用干浸膏中梔子苷含量作為數據分析的依據，結果不具有參考價值，正交試驗方差分析數據也不夠準確，故本研究中采用梔子苷的轉移率為考察指標。其含量測定方法參考了2015 年版《中國藥典（一部）》梔子藥材的液相色譜條件，即以乙腈-水（15 ∶85，V/ V）為流動相，檢測波長為238 nm，結果分離效果不好且峰形拖尾；后采用乙腈-0.1%磷酸水溶液（15 ∶85，V / V）為流動相，流速為1 mL / min，檢測波長為230 nm，能較好地將梔子苷分離[12-16]。

本研究中取正交試驗的1 號試驗條件所得的1 號浸膏適量，依法制備供試品溶液，分別在色譜條件小的變動條件下[流速（0.8±0.2）mL/min，波長（254±2）nm，柱溫（40±5）℃]，測得梔子苷含量的RSD為0.99%，表明高效液相色譜法測定梔子苷時，波長、流速、柱溫在小的變動時耐用性合適，滿足系統適應性要求，方法可靠、可行。

綜上所述，梔子中的梔子苷可作為柴黃清胰活血顆粒水提工藝的考察指標，有利于提高該顆粒的質量標準，本研究中建立的高效液相色譜法快速、準確、靈敏度高，可作為柴黃清胰活血顆粒生產過程中的質量控制方法。