家兔體內泊那替尼固體脂質納米粒藥代動力學研究

熊遠果，高潔芳，沈 瑤，張 洪

（武漢大學人民醫院藥學部，湖北 武漢 430060）

泊那替尼（ponatinib）是繼第1 代酪氨酸酶抑制劑（TKI）伊馬替尼和第2 代達沙替尼之后的新一代替尼類藥物，主要用于成人耐藥性慢性粒細胞白血病和費城染色體陽性的急性淋巴細胞白血病的治療，包括難抑制的T315I 突變[1]，且對加速期耐藥性白血病也有一定的臨床效果。藥理學試驗證明，泊那替尼通過與三磷酸腺苷（ATP）競爭BCL-ABL 融合蛋白中結合位點，從而抑制融合蛋白的表達[2]。但目前泊那替尼上市制劑為僅為口服速釋片，其不良反應率高，嚴重限制了其臨床應用范圍[3-4]。固體脂質納米粒（SLN）是近年來興起的以類脂材料為核心的納米粒給藥體系[5]。其脂質材料具有良好的生物相容性和靶向性，緩控釋效果顯著，可降低藥物的毒副作用[6-7]，且具有較好的穩定性，可用于多種不同的給藥途徑，并可進行大規模工業生產等優點，應用前景廣泛[8-10]。為促進泊那替尼更安全、有效地用于臨床，本研究中擬將前期制備的泊那替尼固體脂質納米粒（P-SLN）混懸液進行家兔體內藥代動力學試驗，探討新劑型在體內的緩控釋效果及生物利用度，為開發泊那替尼新劑型提供研究基礎。現報道如下。

1 儀器、試藥與動物

1.1 儀器

島津L20 型高效液相色譜儀（UV 檢測器，日本島津公司）；TG328A 型電子分析天平（上海天平儀器廠）；Vortex-2 型渦旋儀（上海滬析實業有限公司）；3K30 型冷凍高速離心機（德國Sigma 公司）。

1.2 試藥

泊那替尼（武漢星耀艾克生物醫藥有限責任公司，批號為06771，含量99.0%）；泊那替尼對照品（上海翰香生化制品有限公司，批號為20121226，含量99.3%）；泊那替尼固體脂質納米粒（自制）；肝素鈉注射液（天津市生物化工制藥廠）；甲醇、乙腈均為高效液相色譜（HPLC）純（美國天地公司）；水為超純水（實驗室自制）；其他試劑均為分析純。

1.3 動物

新西蘭兔12 只，體質量（2.0±0.5）kg，雌雄各半，購自武漢大學動物實驗中心，動物實驗合格證號為SCXK ＜Hubei ＞2014-0201。動物實驗符合動物實驗倫理委員會《實驗動物福利倫理原則》要求。

2 方法與結果

2.1 P-SLN 制備

取泊那替尼10 mg、單硬脂酸甘油酯50 mg、蛋黃卵磷脂100 mg，精密稱定，于（75±2）℃水浴溶于5 mL 的無水乙醇形成有機相。另取150 mg 泊洛沙姆188，溶于10 mL 蒸餾水中，構成水相。將有機相加入水相中，于10 000 r/min 高速乳化10 min，并于等溫1 000 r/min繼續攪拌15 min，除去有機相。隨后快速分散于比例為1 ∶5 的0 ～2 ℃水分散相中，于10 000 r/min 高速均質10 min，即得P-SLN 混懸液。制備的P-SLN 平均粒徑為（155.1±4.32）nm，PDI 為（0.152±0.009 0），Zeta 電位為（ -22.0±1.71）mV，包封率為（67.73±1.84）%（n=3）。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

據預試驗及參考文獻[11]，確定檢測條件。色譜柱：Agilent Zorbax Extend C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.2%三乙胺乙酸緩沖鹽（78 ∶22，pH=7）；檢測波長：280 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2.2.2 溶液制備

取泊那替尼對照品10 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加入適量無水乙醇上下振蕩溶解，定容至刻度，即為100 μg/mL 的對照品貯備液，分別取適量，置10 mL容量瓶中，配制成質量溶度為0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 μg/mL 系列質量濃度梯度的對照品溶液。取一定量的泊那替尼對照品，精密稱定，加入適量0.5%羥甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液，渦旋混勻，即得對照組泊那替尼對照液，作為對照組動物灌胃液。精密量取一定量P-SLN，直接加入生理鹽水配制成均勻溶液，即制劑組P-SLN 溶液，作為給藥組動物灌胃液。

2.2.3 血清樣品處理

取新西蘭兔全血，置經肝素鈉處理后的離心管中，于低溫4 ℃下，10 000 r/min 冷凍離心10 min，取離心后的上清液，作為空白血清樣品。精密量取200 μL 血清樣品，加入200 μL 冷甲醇沉淀蛋白，渦旋振蕩混合5 min，于10 000 r/min 離心15 min，取上清液20 μL 過0.45 μm尼龍膜濾過后進樣。

2.2.4 方法學考察

專屬性試驗：取新西蘭兔空白血樣、空白血樣，加適量泊那替尼對照品溶液和給藥后血樣樣品，按照2.2.3項下方法處理后，按擬訂色譜條件進樣，得色譜圖（見圖1）。結果表明，在此條件下，空白血樣對樣品含量測定無干擾，該方法專屬性好。

線性關系考察：精密量取適量質量濃度的對照品溶液，置試管中，氮氣吹干，取空白血樣200 μL，渦旋混勻，制成血藥濃度為0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 μg/mL 的樣品，按2.2.3 項下方法處理后，按擬訂色譜條件進樣，記錄色譜圖，計算峰面積。以測定血樣峰面積平均值（A）對血樣濃度（C，μg/mL）進行線性回歸，得回歸方程A=20 067C-1 347，r=0.999 4 （n=5）。結果表明，泊那替尼血樣質量濃度在0.2 ～10.0 μg/mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取適量泊那替尼對照品溶液，氮氣吹干，加入空白血漿，分別精密配制高、中、低（5.0，1.0，0.2 μg/mL）3 種不同質量濃度的血樣溶液，按2.2.3 項下方法處理后，按擬訂色譜條件進樣，于1 d 內連續進樣5 次，不同天內，每天進樣1 次，連續5 d，記錄色譜圖進行計算。結果日內精密度的RSD分別為1.14%，0.90%，1.83% （n=5），日間精密度的RSD為0.25%，1.25%，1.37%（n=5）。

提取回收率試驗：取適量泊那替尼對照品溶液，氮氣吹干，加入空白血漿，分別精密配制高、中、低（5.0，1.0，0.2 μg/mL）3 種不同質量濃度的血樣溶液，按2.2.3 項下方法處理后，按擬訂色譜條件進樣，記錄色譜圖。同時，取相同質量濃度未經過處理的對照品溶液進樣，記錄色譜圖。計算提取回收率，每個試驗重復3 次。結果平均加收率分別為85.69%，87.95% ，86.45%，RSD為3.40%，6.32%，5.92%，表明該方法提取回收率滿足生物樣品測定要求。

方法回收率試驗：取適量泊那替尼對照品溶液，氮氣吹干，加入空白血漿，分別精密配制高、中、低（5.0，1.0，0.2 μg/mL）3 種不同質量濃度的血樣溶液，按2.2.3 項下方法處理后，按擬訂色譜條件進樣，記錄色譜圖，代入標準曲線，得到對應質量濃度，與加入的已知質量濃度相比，計算方法回收率，每個試驗重復3 次。結果平均加收率分別為97.02%，103.13%，105.33%，RSD為2.17%，5.50%，3.52%，表明方法回收率滿足生物樣品測定要求。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 藥代動力學試驗

將12 只健康新西蘭兔，雌雄各半，隨機分為2 組，每組6 只。給藥前，動物均禁食12 h，按15 mg/kg 劑量分別給對照組和給藥組動物灌胃給藥泊那替尼對照品溶液和P-SLN 溶液。給藥后，分別于0.5，1.0，1.5，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，24.0 h 耳緣靜脈取血2.0 mL。所取的全血樣品置肝素化的離心管中，于低溫4 ℃下10 000 r/min 冷凍離心10 min，取上清液保存于-20 ℃冰箱內。

將上述采集的血樣，按照2.2.3 項下方法處理后，按擬訂色譜條件進樣，記錄色譜圖，代入標準曲線，測定不同時間點的血藥濃度。以時間為橫坐標（）、血藥濃度為縱坐標（Y），作P-SLN 的藥-時曲線，詳見圖2。對所測得的血藥濃度數據，采用DAS 2.0 藥代動力學軟件進行擬合，得對照組和制劑組的藥代動力學參數，詳見表1。采用SPSS 20.0 統計學軟件對所得參數進行t檢驗。由圖2 和表1 可見，與對照組比較，P-SLN 溶液在口服后，其藥時曲線下面積（AUC）是對照組的3.39 倍，AUMC 為14.87 倍，平均滯留時間（MRT）是4.55 倍，半衰期（t1/2）為4.44 倍，清除率（CL）為0.29 倍（P＜0.001）。結果顯示，將泊那替尼制成固體脂質納米粒后，其生物利用度顯著提高，體內滯留時間增加，清除率降低，半衰期延長，緩釋效果顯著，達到了試驗預期目標。

圖2 P-SLN 藥-時曲線圖（n=6）

表1 P-SLN 口服給藥后藥代動力學參數（±s，n=6）

表1 P-SLN 口服給藥后藥代動力學參數（±s，n=6）

注：與對照組相比，*P ＜0.001，#P ＜0.01。

項目AUC[（μg/mL）·h]AUMC（μg/mL）MRT（h）t1 /2（h）CL [（mg/kg）/h/（μg/mL）]V（L/kg）對照組3.53±0.21 9.38±2.26 2.63±0.59 1.82±0.41 4.26±0.24 11.12±1.92給藥組11.98±0.74*139.44±6.75*11.65±0.27*8.08±0.19*1.26±0.080*14.66±1.26#

3 討論

泊那替尼作為一種全新的小分子藥物，上市時間較短，目前對其在體內血藥濃度檢測的方法學報道較少。本研究中在前期試驗的基礎上，進一步優化了檢測條件，結果顯示，優化后的HPLC 法準確性、專屬性和重復性均表現良好。相較于LC-MS 法[12]及酶聯免疫吸附法（ELISA）[13]，該方法避免了對精密儀器的依賴和昂貴專用試劑的使用，操作簡單，成本較低，適用于大規模臨床血樣濃度的測定。

本研究中，血藥濃度檢測受到血樣蛋白的干擾較大。根據參考文獻[14]，主藥泊那替尼與血清蛋白結合率為99%，故前期對蛋白的處理尤其重要。試驗選用了不同比例的甲醇、乙腈、氯仿等多種溶劑沉淀血清蛋白，結果顯示，等體積的甲醇除蛋白效果良好。一方面避免了樣品過度稀釋，降低了檢測限；另一方面避免了高危溶劑的使用，保護了試驗者的安全。同時，還研究了萃取法對試驗影響，結果顯示，液-液萃取降低了血藥中的主藥含量，且相關蛋白未能除盡，影響檢測結果的準確，故最終確定采用等體積甲醇處理樣品。

藥代動力學試驗中，給藥組藥-時曲線顯示有2 個吸收峰。第1 個峰為吸附在納米粒表面的泊那替尼釋藥吸收，第2 個峰為包封于固體脂質納米粒核心的主藥的釋放[15]。2 個吸收峰之間的峰谷，可能與淋巴細胞的清除有關[16]。在釋藥的后期，給藥組消除速率慢于對照組，表明在內環境中，納米粒釋藥速率減慢，藥物的清除率降低，滯留時間延長，緩釋效果明顯[17-18]。結果顯示，將泊那替尼制成固體脂質納米可提高其在家兔體內的生物利用度。

在動物實驗過程中，對照組動物表現為活動范圍縮小、活動頻率降低、欲望減弱，并伴有腹瀉現象。給藥組未出現相關現象，且在活動范圍頻率上表現為前后無明顯差異，同時未觀測到有胃腸道不良反應發生，表明將泊那替尼包封于脂質納米粒內可降低其在體內的不良反應。另外，本研究結果顯示，脂質納米粒的生物利用度顯著高于對照組，可在保證相同的生物利用度上，降低單次給藥劑量，且可進一步降低不良反應的發生率。