TP53 基因沉默介導PI3K/PTEN/AKT 信號通路對腎透明細胞癌侵襲轉移的調控機制

劉曉麗，龐文帥，黃朝康，朱 磊

（河北醫科大學附屬邢臺市人民醫院病理科，河北 邢臺 054001）

腎癌是一類多基因相關腫瘤，發病機制復雜[1]。研究發現，細胞內環境紊亂（細胞內信號轉導途徑不平衡）為主的機體內環境失衡被認為是腫瘤發展的重要因素[2]。同源性磷酸酶-張力蛋白（PTEN）為常見抑癌基因，PI3K/PTEN/AKT 信號通路處于腫瘤細胞生長調節的中心環節，該通路的活化可抑制外源性刺激對腫瘤細胞凋亡的誘發作用，進而促進細胞的生存能力和增殖轉移，在腫瘤進程中發揮重要作用[3]。PI3K/PTEN/AKT信號通路關聯基因之一腫瘤蛋白p53 基因（TP53）為常見促癌基因，參與眾多腫瘤發病[4]。本研究中探討了TP53 基因沉默介導PI3K/PTEN/AKT 信號通路對腎透明細胞癌侵襲轉移的調控機制，為臨床腎透明細胞癌的治療提供參考。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑：DMEM 培養基（美國Gibco 公司）；Lipofectamine?2000 轉染試劑、Trizol 試劑盒均購自美國Invitrogen 公司；表達載體構建（北京信諾金達生物科技有限公司）；免疫組化和Western Blot 抗體（英國Abcam 公司）；DAB 顯色底物、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、RIPA 裂解液、CCK-8 試劑、ECL 發光液均購自上海碧云天生物技術有限公司；PCR 擴增儀、ABI7500 型定量PCR 儀均購自美國賽默飛世爾科技公司；PCR 引物合成（南京金斯瑞生物科技有限公司）；BCA 定量試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司）。

細胞：人腎透明細胞癌細胞株RLC-310（中國科學院上海細胞研究所）；人正常腎臟上皮細胞（江蘇齊氏生物科技有限公司）。

患者納入標準：經病理組織學或細胞學確診，或有典型臨床特征確診為腎透明細胞癌；年齡32 ～76 歲；術前未接受放化療或其他抗腫瘤治療。

患者排除標準：患有其他原發性惡性腫瘤且對本研究產生影響；臨床資料不完整；不配合研究。

標本：選取我院2016 年至2018 年收治的手術患者60 例，其中男36 例，女24 例；年齡32 ～76 歲，平均（56.63±7.44）歲，術后病理檢查均確診為腎透明細胞癌。選取患者的腫瘤組織及癌旁組織，各組織標本采集后均置含RNA 保存液的凍存管中，并立即置-80 ℃凍存，備用。標本采集已得到患者本人及其家屬同意。

1.2 方法

細胞培養與細胞轉染分組：取人腎透明細胞癌細胞株RLC-310，用含10%胎牛血清、100 μg/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養基，于37 ℃及5%CO2恒溫培養箱內常規培養。細胞生長至70% ～80%融合度時用0.25%胰酶消化，進行傳代。RLC-310 細胞轉染分組為空白組（細胞不轉染，A 組）、陰性對照組[細胞轉染短發夾RNA（shRNA），B 組]、shTP53 組（細胞轉染TP53 shRNA，C 組）、PTEN 抑制劑bpv 組[細胞轉染空載體，PI3K/PTEN/AKT 信號通路激活劑（phen）處理細胞，D 組]、phen+shTP53 組（細胞轉染TP53 shRNA，并用phen 處理細胞，E 組）。細胞培養用6 孔板，以1×106個細胞/孔鋪板，使用不含血清的DMEM 新鮮培養基，在細胞密度約占培養板80% 時，使用Lipofectamine? 2000 轉染試劑將表達載體加入到培養基中進行轉染，轉染24 h 后加入phen 處理細胞，作用24 h 后更換為含10%胎牛血清的DMEM 2 mL，繼續于37 ℃、5% CO2孵箱中培養72 h。將各組RLC-310 細胞接種于24 孔板內，加入DMEM 新鮮培養基至各組細胞中，并置37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養48 h。

免疫組化檢測：取出組織標本，用10%甲醛固定，石蠟包埋，5 μm 連續切片。切片在60 ℃恒溫箱中烤片1 h，常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水；3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶；微波抗原修復；10%山羊血清封閉；加兔抗人TP53 一抗；加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白（IgG）。DAB 顯色后，蘇木素復染，用中性樹脂固定封片。以PBS 代替一抗作陰性對照。在高倍鏡下選取5 個視野計數細胞并拍照，著色為棕黃色為陽性表達，根據陽性細胞占全部細胞的比例計算TP53 的陽性細胞率。

實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測：采用Trizol試劑盒提取各組RLC-310 細胞的總RNA，取5 μL RNA 樣品，用無RNA 酶超純水稀釋20 倍，讀取其在紫外分光光度計260 nm 和280 nm 波長處的吸光度，測定RNA濃度和純度。用PCR 擴增儀進行逆轉錄反應合成cDNA模版，應用ABI7500 型定量PCR 儀進行實時定量RTPCR 試驗。采用相對定量法計算，用2-ΔΔCt表示各目的基因的相對表達量，每個試驗均重復3 次，取平均值。

Western Blot 檢測：將各組RLC -310 細胞加入100 μL RIPA 裂解液裂解，預冷PBS 洗3 遍，將細胞刮下，移至1.5 mL 離心管中使細胞充分裂解，14 000g離心10 min，取上清液置-20 ℃保存。試驗時再將樣品取出，用BCA 定量試劑盒進行定量，后加入上樣緩沖液，95 ℃煮10 min 后，上樣30 μg，在100 V 電壓下電泳90 min，通過聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離蛋白后采用濕轉方法將蛋白轉膜，用5% BSA 室溫下封閉1 h 后孵育一抗，4 ℃過夜。其中一抗為TP53、PTEN、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、AKT、GAPDH。一抗孵育完畢后，用1×TBST 溶液室溫下搖床搖動洗膜，每次5 min，洗3 次，加一抗相應的二抗山羊抗兔IgG -HRP 溫育后放入ECL 發光液顯色。利用Quanity One 軟件進行蛋白條帶灰度分析。

CCK-8 法檢測：取各組RLC-310 細胞進行常規消化，用含5%胎牛血清的DMEM 培養基重懸細胞并計數，以5.0×103個/孔接種于96 孔板中，每組設3 個復孔。置培養箱分別培養24，48，72，96 h 后，吸去培養基，PBS 沖洗，加入100 μL 無血清培養基和10 μL CCK-8液體，37 ℃孵育30 min 后，用酶標儀于490 nm 波長處讀取吸光度，取重復試驗的平均值，繪制生長曲線。

創口愈合試驗：各組細胞轉染48 h 后，接種至24孔板中，待細胞生長至密度為80% ～90%時進行轉染，轉染6 h 后更換新的培養基，在37 ℃、5% CO2培養箱中，加入含10%胎牛血清的DMEM 培養基，培養至細胞長滿培養板，使用槍頭垂直于細胞培養板劃痕，然后使用PBS 溶液沖洗細胞3 次，在0，24，48 h 拍照并測量劃痕寬度。計算創口愈合率。

Transwell 侵襲試驗：收集各組轉染細胞重新懸浮于無血清培養基中，取細胞懸液接種于Transwell 的上室，每孔15 μL，37 ℃包被1 h。在小室下層孔中加入750 μL含15%胎牛血清的DMEM 完全培養基，將Transwell 小室置入37 ℃、5% CO2培養箱培養48 h，用棉棒擦去嵌室底部內表面未穿透的細胞及Matirgel 膠，4%甲醛固定，結晶紫染色。在顯微鏡下計數5 個單獨視野的穿膜細胞數。

1.3 統計學處理

采用SPSS 21.0 統計學軟件進行分析。計量資料以表示，兩組間及多組間均數比較行t檢驗及單因素方差分析；計數資料以率（%）表示，行χ2檢驗。P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TP53 蛋白陽性表達檢測結果

各組織切片中TP53 蛋白表達呈陽性，染色為棕黃色，詳見圖1 A。與癌旁組織組相比，癌組織組的TP53蛋白陽性表達率顯著增加[36.67%（22/60）vs.80.00%（48/60），P ＜0.05]，詳見圖1 B。

2.2 細胞mRNA 和蛋白表達水平

qRT-PCR 檢測結果發現，與人正常腎臟上皮細胞相比，RLC-310 細胞的TP53 的mRNA 表達水平顯著增加，組間比較，差異有統計學意義[（0.98±0.04）vs.（1.64±0.07），P ＜0.05]。細胞轉染分組后，qRT-PCR和Western Blot 檢測各組細胞TP53，PTEN，PI3K，AKT基因的mRNA 和蛋白表達水平見圖2 和圖3。可見，與A 組相比，B 組的TP53，PTEN，PI3K，AKT mRNA 和蛋白表達水平均無顯著變化（P ＞0.05）；C 組的TP53，PI3K，AKT mRNA 和蛋白表達水平顯著下降，PTEN mRNA 和蛋白表 達水平均顯 著上升（P ＜0.05）；D 組TP53，PI3K，AKT mRNA 和蛋白表達水平均顯著上升，PTEN mRNA 和蛋白表達水平均顯著下降（P ＜0.05）；E 組的PTEN，PI3K，AKT mRNA和蛋白表達水平均無顯著變化（P ＞0.05），TP53 的mRNA 和蛋白表達水平均顯著下降（P ＜0.05）。

圖1 TP53 蛋白陽性表達檢測結果

圖2 各組細胞qRT-PCR 檢測結果

圖3 各組細胞Western Blot 檢測結果

2.3 細胞轉染后增殖能力

各組RLC-310 細胞的增殖能力見圖4。可見，與A 組相比，B 組和E 組的增殖能力均無顯著變化（P ＞0.05），C 組的增殖能力顯著降低（P ＜0.05），D 組的增殖能力顯著升高（P ＜0.05）。

圖4 各組細胞增殖能力比較（490 nm）

2.4 細胞轉染后遷移和侵襲能力

各組RLC-310 細胞通過劃痕愈合試驗和Transwell試驗分別檢測其遷移和侵襲能力，通過測量各組細胞劃痕寬度變化來計算遷移率，并通過侵襲細胞數計算侵襲率，結果見圖5。可見，與A 組相比，B 組和E 組的遷移率和侵襲率均無顯著變化（P ＞0.05），C 組的遷移率和侵襲率顯著降低（P ＜0.05），D 組的遷移率和侵襲率顯著升高（P ＜0.05）。

圖5 各組細胞遷移能力和侵襲能力比較

3 討論

腎透明細胞癌屬腎實質癌常見類別，起病隱匿，是來源于腎小管上皮細胞的腺癌[5]。作為常見泌尿系統惡性腫瘤，腎癌的發病率和死亡率均較高，且呈逐年上升趨勢[6]。腎癌常見治療手段為手術治療，根治性腎切除多用于早期局限性腎癌，但尚有部分腎癌患者因遠處轉移而無法接受手術治療，生存率極低，預后較差[7]。同時，晚期腎癌及轉移性腎癌患者均具有較強耐藥性[8]。隨著對腎癌分子機制認識的深入，有研究發現傳統腫瘤療法缺乏特異性，并伴有明顯毒副作用[9]，已不能滿足當代腫瘤治療的需求。近年來，信號轉導途徑中的某些關鍵分子已成為分子靶向治療的研究熱點。該治療基于腫瘤分子生物學，以腫瘤特異性分子作為靶點，應用分子制劑，確認可供治療干預的分子靶點（促癌基因、抑癌基因、信號轉導通路等）。

諸多信號轉導途徑中，PI3K/PTEN/AKT 信號通路是目前研究較成熟的通路，其活化可促進細胞生長轉移[10]。PTEN 是該通路的主要因子之一，可抑制PI3K 的功能并對抗AKT 的活化，在多類腫瘤如腦膠質瘤中等均存在缺失或突變[11-12]。同時，PI3K 的關鍵功能在于介導組織細胞凋亡，活化的PI3K 可激活細胞信號轉導，并與AKT 蛋白相互作用，轉位至細胞核或細胞漿，進而調控細胞活性，并抑制細胞凋亡[13]。本研究結果顯示，TP53 蛋白在腎透明細胞癌中呈陽性表達，且與癌旁組織組相比，癌組織組的TP53 蛋白陽性表達率顯著增加，提示TP53 異常高表達可能與腎透明細胞癌的發病有關，該推測在細胞試驗中亦得到證實，RLC -310 細胞的TP53 的mRNA 表達率顯著高于正常人腎臟上皮細胞中的水平。另外，推測該蛋白可能通過促進細胞增殖誘發該腫瘤的發生。若可抑制TP53 表達或干擾其目標信號轉導通路，可為該腫瘤的早期診斷和治療提供新思路。

qRT-PCR 和免疫印跡法檢測各組細胞TP53，PTEN，PI3K，AKT 基因的mRNA 和蛋白表達水平的結果顯示，抑制TP53 基因表達可抑制PI3K/PTEN/AKT信號通路的激活，誘發抑癌基因PTEN 活性，而phen 處理可導致該信號通路的激活，并抑制PTEN 活性；沉默TP53 基因可逆轉phen 誘導的PI3K/PTEN/AKT 信號通路的激活，有助于抑制該腫瘤的發生、發展。上述結果經各組細胞轉染后增殖能力、遷移能力和侵襲能力比較，驗證了沉默TP53 基因表達在抑制phen 誘導的腎透明細胞癌細胞浸潤轉移中的作用。

綜上所述，TP53 在腎透明細胞癌中高表達，可通過抑制該基因的表達來發揮腫瘤抑制作用，TP53 基因可作為腎透明細胞癌診療的指標。沉默TP53 基因抑制PI3K/PTEN/AKT 信號通路，從而抑制腎透明細胞癌細胞浸潤轉移功能，并可逆轉phen 誘導的腎透明細胞癌細胞浸潤轉移，對腎透明細胞癌的診治作用顯著。