貝類(lèi)精氨酸激酶致敏性的研究進(jìn)展

趙曉涵，張江濤，李國(guó)明，朱艷，谷瑞增，魯軍

中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心（北京 100015）

食物過(guò)敏（FA）又稱為食物變態(tài)反應(yīng)，是因?yàn)槿藗兪秤媚撤N食品或食品添加劑后引起的IgE介導(dǎo)或非IgE介導(dǎo)的異常免疫反應(yīng)，從而使人體的組織系統(tǒng)產(chǎn)生多種不良癥狀。任何食物都可能誘發(fā)變態(tài)反應(yīng)，各種食物和制備方法是每個(gè)群體文化特征的一部分，因此引起癥狀的主要食物因地理位置而有所不同[1]。食物過(guò)敏原指的是能引起免疫反應(yīng)的食物抗原分子。幾乎所有食物過(guò)敏原都是蛋白質(zhì)，大多數(shù)為水溶性糖蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為10～70 kDa。食物過(guò)敏是一種日益引起人們重視的食品安全問(wèn)題，也是兒童中最常見(jiàn)的慢性非傳染性疾病[2]。目前尚無(wú)治療食物過(guò)敏的方法，但在IgE介導(dǎo)的過(guò)敏管理方面取得令人興奮的進(jìn)展，包括通過(guò)預(yù)期篩查測(cè)試，早期引入常見(jiàn)食物過(guò)敏原，主動(dòng)耐受誘導(dǎo)，使用生物制劑和主動(dòng)風(fēng)險(xiǎn)管理[3]。有學(xué)者開(kāi)發(fā)口服（OIT），舌下（SLIT）和表皮（EPIT）免疫療法作為食物過(guò)敏的積極治療，但沒(méi)有人完成3期研究[4]。此外，在高危嬰兒中早期引入可能的食物過(guò)敏原以積極預(yù)防食物過(guò)敏將是減緩過(guò)敏率上升的重要手段[5]。雖然嚴(yán)格避免食用過(guò)敏食物是患者的最佳選擇，但食物配料的多樣化及組成的復(fù)雜性，容易發(fā)生過(guò)敏原的意外攝入和過(guò)敏反應(yīng)[6]，而且患者在長(zhǎng)期忌食過(guò)敏食物過(guò)程中，往往會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)缺失，容易發(fā)生病理性飲食行為，對(duì)患者及其家庭的生活質(zhì)量產(chǎn)生重大影響[7]。目前主要研究的幾種食物過(guò)敏治療策略有望為患者提供治療或長(zhǎng)期緩解，但只有降低或消除過(guò)敏原的致敏性才是防止食物過(guò)敏的根本解決之法。

1 貝類(lèi)過(guò)敏

由于烹飪的原因，甲殼類(lèi)和軟體動(dòng)物這2種無(wú)脊椎動(dòng)物通常被稱為貝類(lèi)。甲殼類(lèi)動(dòng)物與蛛形綱動(dòng)物和昆蟲(chóng)一起統(tǒng)稱為節(jié)肢動(dòng)物。在世界范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)5萬(wàn)多種活甲殼類(lèi)動(dòng)物，許多甲殼類(lèi)動(dòng)物都可以生吃或熟吃。軟體動(dòng)物也是一個(gè)龐大而多樣化的群體，細(xì)分為雙殼類(lèi)、腹足類(lèi)和頭足類(lèi)，包括近10萬(wàn)種不同的物種，包括一些具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的海鮮類(lèi)，如貽貝、牡蠣、鮑魚(yú)和魷魚(yú)。貝類(lèi)種類(lèi)繁多，因其肉質(zhì)肥嫩、營(yíng)養(yǎng)豐富而深受消費(fèi)者的喜歡，而且隨著貝類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)、物流業(yè)和冷鏈的發(fā)展，貝類(lèi)逐漸成為居民食物消費(fèi)的重要組成部分，且消費(fèi)市場(chǎng)不斷擴(kuò)大[8]。

貝類(lèi)過(guò)敏作為食物過(guò)敏中的一種，主要是由IgE介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)引起的Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)[9]。過(guò)敏原通過(guò)攝入、吸入或接觸進(jìn)入機(jī)體后，誘發(fā)B細(xì)胞產(chǎn)生特異性IgE抗體，IgE與肥大細(xì)胞/嗜堿性顆粒細(xì)胞結(jié)合成為致敏靶細(xì)胞。當(dāng)機(jī)體再次接觸相同過(guò)敏原刺激時(shí)，過(guò)敏原就會(huì)與靶細(xì)胞上的IgE結(jié)合發(fā)生特異性反應(yīng)，釋放炎癥因子作用于效應(yīng)組織和器官，從而引發(fā)急性過(guò)敏反應(yīng)，如哮喘、蕁麻疹、流涕等[10]。在全球范圍內(nèi)，最常見(jiàn)的致敏貝類(lèi)是蝦、蟹、龍蝦、蛤、牡蠣和貽貝。據(jù)估計(jì)，貝類(lèi)過(guò)敏的患病率為一般人口的0.5%～2.5%，在中國(guó)沿海地區(qū)甚至是內(nèi)陸地區(qū)，食用貝類(lèi)后引起過(guò)敏反應(yīng)的事件逐年增多。

不同貝類(lèi)可能含有一種或多種過(guò)敏原。隨著多種新型貝類(lèi)過(guò)敏原的不斷發(fā)現(xiàn)，已知的貝類(lèi)過(guò)敏原有原肌球蛋白（TM）、精氨酸激酶（AK）、肌球蛋白輕鏈（MLC）、肌鈣結(jié)合蛋白（SCP）、血藍(lán)蛋白亞基（HCS）[11]等，因此，主要對(duì)精氨酸激酶AK過(guò)敏原進(jìn)行介紹。

2 精氨酸激酶（AK）

精氨酸激酶是貝類(lèi)中對(duì)熱、酸、堿均不穩(wěn)定的過(guò)敏原之一，盡管已觀察到一些二聚體AK，但其通常以單體形式被發(fā)現(xiàn)。AK結(jié)構(gòu)復(fù)雜，它由一個(gè)大的C端結(jié)構(gòu)域和一個(gè)小的α螺旋形成的N端結(jié)構(gòu)域組成，C端結(jié)構(gòu)域與Glu合成酶的C端結(jié)構(gòu)域類(lèi)似，7個(gè)α-螺旋將8股串起來(lái)的反平行β-折疊包繞起來(lái)。如圖1所示。

圖1 精氨酸激酶三維結(jié)構(gòu)圖

精氨酸激酶是無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)主要的磷酸原激酶，參與控制細(xì)胞的ATP水平，在無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)有調(diào)節(jié)能量代謝的作用[12]。不同貝類(lèi)中，甲殼類(lèi)動(dòng)物如南美白對(duì)蝦、斑節(jié)對(duì)蝦、蝦蛄中含量較多；軟體動(dòng)物如太平洋牡蠣、魷魚(yú)、縊蟶及蛤蜊中的相對(duì)含量則較少，說(shuō)明在不同種類(lèi)貝類(lèi)中，AK的相對(duì)含量有較大區(qū)別[13]。精氨酸激酶在無(wú)脊椎動(dòng)物中分布廣泛，生理功能相似，根據(jù)蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)及相對(duì)分子量，可以將精氨酸激酶劃分為三類(lèi)：?jiǎn)蝸喕彼峒っ福沁@三類(lèi)里目前研究較多的一種，如中國(guó)明對(duì)蝦、海灣對(duì)蝦、鋸緣青蟹、牡蠣中的精氨酸激酶，相對(duì)分子量約40 kDa[14-15]；雙亞基精氨酸激酶，如海參、北極貝、深海蛤蜊中的精氨酸激酶為二聚體[16-17]，其相對(duì)分子質(zhì)量約80 kDa；四亞基精氨酸激酶，如環(huán)節(jié)動(dòng)物，相對(duì)分子量為150～160 kDa。

泛過(guò)敏原是指具有免疫交叉反應(yīng)性結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的一類(lèi)過(guò)敏原[18]，這些過(guò)敏原的共同特點(diǎn)是它們?cè)谙到y(tǒng)進(jìn)化的過(guò)程中保持著較高的序列相似性。毛海燕[19]通過(guò)RACE的方法成功克隆擬穴青蟹AK的cDNA序列，其編碼357個(gè)氨基酸，氨基酸序列分析結(jié)果表明，擬穴青蟹AK與其他甲殼類(lèi)AK之間具有較高同源性，經(jīng)軟件分析表明甲殼類(lèi)精氨酸激酶的活性位點(diǎn)在271～277位（CPTNLGT）氨基酸之間[20]。過(guò)去學(xué)者對(duì)AK研究主要集中于它在機(jī)體能量代謝調(diào)節(jié)和酶學(xué)性質(zhì)方面的作用，直到2001年，Binder等[21]從102份對(duì)玉米面粉蛾過(guò)敏的患者血清中發(fā)現(xiàn)其中5份血清具有AK的特異性IgE抗體，證明AK是引起人對(duì)玉米面粉蛾過(guò)敏的過(guò)敏原，同時(shí)指出分子量40 kDa的蟑螂精氨酸激酶與蛾類(lèi)、塵螨、龍蝦、對(duì)蝦、貝類(lèi)有一定免疫交叉反應(yīng)，說(shuō)明AK是甲殼類(lèi)動(dòng)物、軟體動(dòng)物甚至昆蟲(chóng)中的泛過(guò)敏原。然而，大多數(shù)交叉反應(yīng)性研究是基于分子和免疫學(xué)發(fā)現(xiàn)，而不一定是基于臨床反應(yīng)性[22]。盡管AK在甲殼類(lèi)和軟體動(dòng)物之間的交叉反應(yīng)性被廣泛報(bào)道，但對(duì)其分子特性研究還很有限。對(duì)AK的分子研究表明，一些AK氨基酸序列的高同源性導(dǎo)致該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)（蛋白折疊）具有高相似性，從而可能導(dǎo)致交叉反應(yīng)[23-24]。精氨酸激酶作為過(guò)敏原的研究尚處于起步階段，Yu等[25]發(fā)現(xiàn)蝦類(lèi)的新精氨酸激酶過(guò)敏原Pen m 2，與過(guò)敏血清的反應(yīng)率為33%～39%，該蛋白由359個(gè)氨基酸殘基組成，廣泛存在于各種甲殼類(lèi)動(dòng)物中，如蝦、蟹等。García-Orozco等[26]純化太平洋白蝦的精氨酸激酶，并對(duì)其擴(kuò)增測(cè)序，指出其是首次報(bào)道的太平洋白蝦過(guò)敏原，與Pen m 2有96%同源性。

3 精氨酸激酶的致敏性與抗原表位

研究表明，過(guò)敏原能夠引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)是抗原表位，也稱為抗原決定簇，指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，一般位于抗原分子的表面。抗原表位能夠被特定的抗體或免疫細(xì)胞受體識(shí)別，從而引起免疫反應(yīng)。貝類(lèi)AK引發(fā)的過(guò)敏反應(yīng)是由IgE介導(dǎo)產(chǎn)生的，因此國(guó)內(nèi)外對(duì)貝類(lèi)AK過(guò)敏原表位的研究主要集中于解析其IgE結(jié)合位點(diǎn)[27]。在食物過(guò)敏原抗原表位的研究中，一般根據(jù)表位的結(jié)構(gòu)將其分為構(gòu)象型（不連續(xù)型）和線型（連續(xù)型）兩種。深入研究食物過(guò)敏原抗原表位可以指導(dǎo)科研人員選擇有效的理化和生物方法來(lái)降低甚至消除貝類(lèi)過(guò)敏原的致敏性。過(guò)敏原檢測(cè)和免疫治療都基于抗原表位，運(yùn)用分子生物學(xué)、蛋白組學(xué)、免疫學(xué)等方法對(duì)過(guò)敏原中特定氨基酸殘基及其位置進(jìn)行確定，將有利于過(guò)敏原檢測(cè)和免疫治療[28]。

3.1 構(gòu)象表位與致敏性

構(gòu)象表位是一些在一級(jí)結(jié)構(gòu)中不連續(xù)但在空間上相互接近的氨基酸殘基或肽段組成的能被特異性IgE抗體識(shí)別的區(qū)域，其致敏性依賴于抗原分子的空間結(jié)構(gòu)[29]。因?yàn)闃?gòu)象表位是通過(guò)蛋白質(zhì)折疊產(chǎn)生，所以定位其表位具有挑戰(zhàn)性。某些食物過(guò)敏原經(jīng)過(guò)加工處理或消化后，蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，使蛋白分子內(nèi)部的表位暴露出來(lái)，從而易于體內(nèi)抗體識(shí)別，或者由于構(gòu)象改變產(chǎn)生新的抗原表位，使其致敏性升高。另一些過(guò)敏原經(jīng)過(guò)蛋白變性或消化后導(dǎo)致部分或全部構(gòu)象表位被破壞使致敏性下降甚至消失。此外，也有一些過(guò)敏原的致敏性不會(huì)因加工處理而發(fā)生明顯變化，這是因?yàn)槠淇乖砦患葲](méi)有被破壞也沒(méi)有新的抗原表位曝露出來(lái)[30]。

3.2 線性表位與致敏性

線性表位，也稱連續(xù)型表位，是在一級(jí)結(jié)構(gòu)上連續(xù)的氨基酸殘基或肽段構(gòu)成的能被抗體分子識(shí)別結(jié)合的小肽段。許多蛋白在經(jīng)過(guò)加工處理后失去原有的構(gòu)象結(jié)構(gòu)，或是在消化后產(chǎn)生的小分子肽段依然具有一定致敏性，所以在食物過(guò)敏反應(yīng)中有些線性表位不僅是構(gòu)象表位的組成部分，也能單獨(dú)發(fā)揮作用[31]。

3.3 精氨酸激酶表位與致敏性的研究進(jìn)展

Ayuso等[32]確定凡納濱對(duì)蝦中的AK（Lit v 2）過(guò)敏原的8個(gè)線性表位（AA：1～18，25～42，64～96，121～141，142～159，160～192，232～255和319～342）。Mao等[33]通過(guò)對(duì)擬穴青蟹AK的分段表達(dá)，確定2個(gè)主要抗原表位區(qū)域（AA：174～181和253～256），并且通過(guò)重疊肽庫(kù)技術(shù)確定3個(gè)線性表位（AA：127～141，141～155和21～225），對(duì)克氏原螯蝦AK、南美白對(duì)蝦AK和章魚(yú)AK的構(gòu)象型抗原表位的預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們與擬穴青蟹AK具有相似的構(gòu)象型抗原表位。楊陽(yáng)[34]通過(guò)噬菌體展示技術(shù)結(jié)合重疊肽技術(shù)、細(xì)胞模型確定擬穴青蟹AK的4個(gè)線性表位：L-AK-1（AA 113～127），L-AK-2（AA 127～141），L-AK-3（AA 141～155）和L-AK-4（AA 204～218），應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)結(jié)合LocaPep軟件分析得到擬穴青蟹AK的4個(gè)構(gòu)象表位：C-AK-1（D3A4K43M1A5T49-T44I7），C-AK-2（L31K33V35T32E11E18F14S34D37），C-AK-3（V177G172M173D176Q178T174L181K175L187）和C-AK-4（R202L170Y203E190P205W204L187T206Y145），擬穴青蟹AK致敏性隨空間構(gòu)象的變化而變化，其分子內(nèi)部的Cys201和Cys271形成的二硫鍵是維持空間構(gòu)象的關(guān)鍵位點(diǎn)，并通過(guò)小鼠動(dòng)物模型進(jìn)一步探究r AK1和r AK2的致敏性，確定AK的抗原表位優(yōu)勢(shì)區(qū)位于r AK1（AA：87～186）。毛海燕[19]發(fā)現(xiàn)擬穴青蟹AK的抗原表位以構(gòu)象型為主，但血清學(xué)的Western-blotting分析證實(shí)AK中也含有線性表位。對(duì)于貝類(lèi)AK的研究相對(duì)于TM而言較少且主要集中在提取純化和分子克隆方面，貝類(lèi)AK抗原表位的研究處于初始階段。

不同貝類(lèi)中AK蛋白結(jié)構(gòu)均有所不同，利用不同加工方法或脫敏技術(shù)處理會(huì)破壞或修飾AK抗原表位，從而影響其致敏性。研究物理法（熱處理、輻照、超高壓等）、化學(xué)法（糖基化修飾、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、水解等）及生物法（酶解、發(fā)酵、基因突變等）的條件改變與貝類(lèi)AK抗原表位關(guān)系的報(bào)道更是少之又少。對(duì)擬穴青蟹AK進(jìn)行溫度穩(wěn)定性試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)AK為熱不穩(wěn)定蛋白，隨著溫度的升高，分子內(nèi)部氫鍵及次級(jí)鍵逐漸被破壞，容易形成聚合物，導(dǎo)致變性、沉淀，因此以構(gòu)象型表位為主的AK過(guò)敏原在經(jīng)過(guò)高溫處理后致敏性會(huì)顯著降低。此外，擬穴青蟹純化AK易被胃蛋白酶降解，對(duì)胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化穩(wěn)定性較強(qiáng)，但對(duì)致敏性的影響仍需深入研究。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

有研究者對(duì)蟹AK的理化性質(zhì)、消化穩(wěn)定性、抗原表位、致敏性及其關(guān)鍵位點(diǎn)等方面進(jìn)行初步探索，但仍存在一些問(wèn)題需要深入研究，對(duì)其他種類(lèi)的貝類(lèi)AK過(guò)敏原，如軟體動(dòng)物AK也需進(jìn)行全面分析研究，完善AK致敏性相關(guān)信息。制備高純度的精氨酸激酶對(duì)其功能分析、特異性抗體制備及免疫鑒定顯得尤為重要，只有對(duì)AK分子克隆技術(shù)進(jìn)行詳細(xì)探究，獲得具有免疫活性的AK，才能加快AK檢測(cè)和治療方面研究；AK的主要表位類(lèi)型是構(gòu)象表位，但構(gòu)象表位的研究是免疫學(xué)界的難題之一，對(duì)食物過(guò)敏原構(gòu)象表位的分析多采用噬菌體展示肽庫(kù)方法，可將該方法運(yùn)用到研究AK過(guò)敏原的試驗(yàn)中，且隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)發(fā)展，有望找到快速繪制AK過(guò)敏原結(jié)構(gòu)以及構(gòu)象IgE表位技術(shù)；致敏性評(píng)估包括動(dòng)物和細(xì)胞模型、胃腸道消化試驗(yàn)法、熱穩(wěn)定性試驗(yàn)法等，使用AK致敏性蛋白表位結(jié)構(gòu)與致敏性評(píng)估結(jié)合的方法，分析構(gòu)象變化與致敏性關(guān)系，探尋控制AK致敏性和脫敏新技術(shù)；研究不同加工方法對(duì)AK的結(jié)構(gòu)及致敏性的影響，優(yōu)化降低AK致敏性加工方法，開(kāi)發(fā)出低致敏性甚至無(wú)致敏性的貝類(lèi)食品。