乙酰膽堿酯酶生物傳感器研究進(jìn)展

呂曉平，郭利靜，李寧，魏月*，杜海英

1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理工學(xué)院（滄州 061100）；2. 河北省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心（保定 071000）；3. 河北省農(nóng)林科學(xué)院棉花研究所（石家莊 050051）

有機(jī)磷農(nóng)藥（Organophosphorus pesticide，OPs）是目前使用較為廣泛的一類(lèi)農(nóng)藥[1]，OPs中毒事件時(shí)有發(fā)生，2016年GB 2763—2016對(duì)各種常見(jiàn)農(nóng)藥的最大殘留量做出了明確規(guī)定。當(dāng)前常見(jiàn)的有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[2]、氣相色譜法[3]、酶聯(lián)免疫法[4]、酶抑制法[5]等，這些檢測(cè)技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)[6]。生物傳感器檢測(cè)技術(shù)因其快速、高效、低成本等優(yōu)點(diǎn)，在有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè)中被廣泛地應(yīng)用[7]。近年來(lái)，應(yīng)用乙酰膽堿酯酶生物傳感器檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的研究尤為突出[8]，文章詳細(xì)總結(jié)了這方面的研究成果。

1 乙酰膽堿酯酶生物傳感器的工作原理及其研究進(jìn)展

1.1 乙酰膽堿酯酶生物傳感器的工作原理

乙酰膽堿酯酶生物傳感器是利用乙酰膽堿酯酶作為識(shí)別和催化元件，乙酰膽堿酯酶與有機(jī)磷農(nóng)藥發(fā)生酶促反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物是一種電活性物質(zhì)，該電活性物質(zhì)與基體電極產(chǎn)生響應(yīng)，基體電極使化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，從而完成對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量的測(cè)定[9-10]。

1.2 乙酰膽堿酯酶生物傳感器的研究進(jìn)展

乙酰膽堿酯酶生物傳感器的電極材料、酶的固定化研究以及酯酶本身的活性是相關(guān)研究的主要內(nèi)容[11-12]。

1.2.1 電極材料

生物膜電極是乙酰膽堿酯酶生物傳感器的核心部分。納米材料由于優(yōu)良的導(dǎo)電性、高靈敏度、響應(yīng)時(shí)間短等特點(diǎn)成為理想的電極材料[13-14]。乙酰膽堿酯酶生物傳感器中常用的納米材料有金[15]、銀[16-17]、碳[18]、復(fù)合材料[19]等，這些生物傳感器對(duì)馬拉硫磷、對(duì)氧磷、毒死蜱、敵敵畏等有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)準(zhǔn)確度有較大幅度的提高，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 不同電極材料的乙酰膽堿酯酶生物傳感器對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)限

接表1

1.2.2 酶的固定化方法

酶的固定化技術(shù)是利用載體將天然游離的酶束縛或限制在一定的空間中，保留其催化活性，是一種常用、便捷、有效的生物酶的修飾手段[20-21]。乙酰膽堿酯酶的固定包括將酯酶固定在酶膜上以及將酶膜固定在電極上兩個(gè)過(guò)程，酶的最終固定結(jié)果將直接影響到檢測(cè)的準(zhǔn)確度、靈敏度以及響應(yīng)時(shí)間，因此酶的固定化技術(shù)一直是近幾年生物傳感器研究的熱點(diǎn)[22-23]。常見(jiàn)的酶的固定化方法包括物理吸附法、包埋法、共價(jià)鍵交聯(lián)法等[24-25]。

1.2.2.1 物理吸附法

物理吸附法是最簡(jiǎn)單且不改變酶性質(zhì)的方法，但這種方法利用酶與載體之間的弱作用力，易發(fā)生酶的脫吸附，不便于操作和保存[26]。Saleemd等[27]使用物理吸附法將乙酰膽堿酯酶固定在介孔硅的納米通道上，該方法在較苛刻的條件下熱穩(wěn)定性能達(dá)到90 ℃，能重復(fù)使用3個(gè)周期，具有較高的實(shí)用價(jià)值。

但該方法最終僅能保留50%的酶活性，不便于乙酰膽堿酯酶的固有催化活性的保持，另外該方法在操作上有一定的難度。因此延長(zhǎng)酶的保存期、提高酶的活性，是物理吸附法突破的關(guān)鍵。

1.2.2.2 包埋法

包埋法是將酶包埋在高聚物的細(xì)微凝膠網(wǎng)格或高分子半透明膜內(nèi)的固定化方法[28]。Itoh等[29]將酶包埋在雜化介孔二氧化硅膜（F127-MST）中，成功制備了乙酰膽堿酯酶生物傳感器的單元，將該單元用于檢測(cè)敵敵畏、對(duì)硫磷等有機(jī)磷農(nóng)藥，檢測(cè)限高于普通乙酰膽堿酯酶生物傳感器，且穩(wěn)定性和重復(fù)性都得到很大提高。

目前，該方法的不足體現(xiàn)在酶的催化速率較快的情況下反應(yīng)產(chǎn)物累積較多，無(wú)法快速及時(shí)地釋放到反應(yīng)的溶劑中，影響反應(yīng)速率嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成膜材料的破裂。

1.2.2.3 共價(jià)交聯(lián)法

共價(jià)交聯(lián)法是將酶與載體通過(guò)共價(jià)鍵的相互作用固定到一起，此方法中最常用的交聯(lián)劑是戊二醛[30]。Rui等[31]將AChe和牛血清蛋白（BSA）通過(guò)靜電吸附作用，將其依次吸附在NH2-SBA-15表面，再加入戊二醛使AChe的氨基交聯(lián)。在最佳固定化條件下，相對(duì)于游離AChE，固定化AChE（AChE-NH2-SBA-15）的比活性達(dá)到約95%，固定效率約為95%。

從以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中可得知，與物理吸附法和包埋法相比較，共價(jià)交聯(lián)法更具優(yōu)勢(shì)。

1.2.3 乙酰膽堿酯酶活性的篩選

孫霞等[32]的研究結(jié)果表明鴨血清中的AChE酶含量豐富，對(duì)常見(jiàn)的有機(jī)磷農(nóng)藥較敏感，且來(lái)源廣泛、廉價(jià)易得，是用于乙酰膽堿酯酶生物傳感器上較理想的一種。

2 乙酰膽堿酯酶生物傳感器的展望

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)、材料和化工等方面研究的不斷發(fā)展，乙酰膽堿酯酶生物傳感器正在由粗放到精細(xì)、由笨重向便捷化方向發(fā)展。乙酰膽堿酯酶生物傳感器較常規(guī)的檢測(cè)手段在準(zhǔn)確度、響應(yīng)時(shí)間、靈敏度等方面有較大的優(yōu)勢(shì)。然而，不可否認(rèn)的是目前的乙酰膽堿酯酶生物傳感器尚存許多亟待突破解決的問(wèn)題[33-34]。

2.1 減少固定化酶過(guò)程中酶活力的損失

在固定化乙酰膽堿酯酶的過(guò)程中，化學(xué)試劑的使用使得很大一部分酶的活性降低甚至失去活性，這就造成了資源和資金的浪費(fèi)，固定化酶的活性與重復(fù)利用周期由載體的特性與結(jié)構(gòu)決定，如該材料的生物相容性與親水性等[35-36]。因此，新型酶固定化材料的研究是未來(lái)固定化技術(shù)研究的一大重點(diǎn)。

2.2 提高酶的復(fù)活率、提升酶的穩(wěn)定性

乙酰膽堿酯酶生物傳感器中所使用的乙酰膽堿酯酶電極大多為一次性消耗品，無(wú)法重復(fù)使用，這就造成了每測(cè)定一種樣品就要更換一次乙酰膽堿酯酶電極，不但增加了酶生物傳感器的資金投入，而且還限制了生物傳感器的自動(dòng)化發(fā)展。如果能提高乙酰膽堿酯酶的復(fù)活率，使其可重復(fù)使用[37]，如Lan等[38]研發(fā)的基于金屬螯合親和固定化甲基對(duì)硫磷水解酶（Mph）光學(xué)生物傳感器裝置，用于有機(jī)磷化合物的檢測(cè)，可以抑制酶活性的不可逆性，提高酶的抗干擾能力。如果合理利用該原理固定化乙酰膽堿酯酶，那么將大幅度提高酶的復(fù)活率、提升酶的穩(wěn)定性。

2.3 向多酶化方向發(fā)展

因?yàn)槊柑赜械膶?zhuān)一性和特異性，使得一種乙酰膽堿酯酶生物傳感器只能測(cè)定出一種或一類(lèi)有機(jī)磷農(nóng)藥[39]，而不能同時(shí)測(cè)定多種有機(jī)磷農(nóng)藥，這就給樣品中各種有機(jī)磷農(nóng)藥的測(cè)定造成了困擾，因此多酶生物傳感器檢測(cè)多種農(nóng)藥是未來(lái)發(fā)展的一種趨勢(shì)。

2.4 向微型、便捷化方向發(fā)展

傳統(tǒng)的乙酰膽堿酯酶生物傳感器體積都比較大，這就給野外作業(yè)或在其它比較復(fù)雜的環(huán)境下的檢測(cè)造成了一定的困擾，因此微型化、便捷化也是生物傳感器必然的發(fā)展方向[40]，如Mishra等[41]發(fā)明的可穿戴的手套生物傳感器以及Guo等[42]發(fā)明的視覺(jué)篩選卡測(cè)定有機(jī)磷農(nóng)藥等方法就為未來(lái)生物傳感器檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的研究提供了方向。

3 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，從乙酰膽堿酯酶生物傳感器的新型電極材料、幾類(lèi)常用的酶的固定化方法、酶活性的篩選等方面闡述了乙酰膽堿酯酶生物傳感器的研究成果以及存在的不足之處。

近年來(lái)，隨著科技的進(jìn)步與創(chuàng)新，有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)技術(shù)也在不斷更新，乙酰膽堿酯酶生物傳感器也已成為快速檢驗(yàn)樣品中有機(jī)磷農(nóng)藥的一種技術(shù)手段，為有機(jī)磷農(nóng)藥的快速檢測(cè)提供了新方向。為現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和分析有機(jī)磷農(nóng)藥的小型、便攜式、有不同固定化酶、可用于樣品中多元混合物的分析與鑒別的乙酰膽堿酯酶生物傳感器仍然是有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)領(lǐng)域的一個(gè)重要發(fā)展趨勢(shì)。