6個紅紫芽茶14種化學成分含量測定比較

念波 ，段雙梅，石興云，馬燕，王興華，趙明 ,

1. 云南農業大學龍潤普洱茶學院（昆明 650201）；2. 云南農業大學云南省藥用植物生物學重點實驗室（昆明 650201）；3. 云南省德宏州茶葉技術推廣站（德宏 678400）；4. 普洱市茶葉科學研究所（普洱 665000）

花青素是在許多植物中發現的植物色素，包括紅葡萄[1]，漿果（藍莓、草莓、黑加侖子、越桔）[2]，茄子[3]，紫薯[4]，芙蓉花[5]，這些色素是自然界中重要的水溶性天然色素，屬于酚類化合物中的類黃酮物質，也是形成花瓣和果實顏色的主要色素之一，可隨細胞液的酸堿改變顏色。在酸性液中偏紅，堿性液中則偏藍[6]?；ㄇ嗨鼐哂泻軓姷目寡趸痆7]，清除體內的自由基[8]，抗癌能力[9]，改善血管壁彈性，從而達到降壓功能[10]；對心血管疾病的防治有很大作用[11-12]，由于花青素對人體的潛在益處，人們對它的興趣因此增加[13]，同時花青素還是一種無毒的天然著色劑[14]，在醫藥、化妝品、食品等領域有著廣闊的發展空間和價值[15]。近年來花青素的營養、藥理等作用逐漸引起關注，具有良好的應用和開發前景。

茶樹（Camellia sinensis（L.）O. Kuntze）是山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）的多年生常綠作物。茶樹葉片顏色一般是黃綠色，但基因改變或受環境因素的影響，芽葉顏色會呈現紅紫色。根據茶葉花青素含量的研究發現芽葉紅字顏色的深淺與花青素含量的多少呈正相關：花青素含量越高，芽葉紫色程度越深[16]。紫娟在紅紫芽茶樹中具有典型代表性，并且國家林業局于2005年11月批準其為植物新品種，并授權給予保護，品種權號20050031[11]。采摘的鮮葉加工可以制成曬青或者烘青，干茶色澤為紫黑色，沖泡茶湯為淡紫色，葉底呈靛青色，香氣純正，味濃回甘[17]。根據動物試驗結果表明，紫娟綠茶降壓效果幅度35.53%，維持至20 min，高于云南大葉群體種綠茶（29.04%，1 min）。紫娟嫩稍內含成分極其豐富，其中最突出的是花青素，據王興華等研究顯示紫娟新稍中花青素含量29.14 mg/g，是日本高花青素茶樹品種“枕佃03—1384”（花青素0.30～0.37 mg）的100倍左右[18]。因紫娟花青素含量高，利用價值高，從而得到廣泛推廣，形成較系統的繁育推廣技術平臺。

紅紫芽茶樹是一種稀有、獨具特色、富含高花青素的茶樹資源[19]。為充分利用紅紫芽茶樹種質資源，試驗對思茅茶樹良種場資源圃中的紫娟和紅紫芽茶進行花青素、兒茶素等測定分析，并與紫娟茶做了比較分析，為培育優質茶葉品種提供試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣品

紫娟和5個不同嫩度的紅紫芽茶鮮葉，于2016年9月采自思茅茶樹良種場資源圃，如圖1。

1.1.2 主要試劑

使用高效液相色譜測定法（HPLC）測定花青素、兒茶素、咖啡堿含量。

甲醇、乙腈（色譜純，美國TEDIA試劑公司）；沒食子酸（GA）標品、咖啡堿（CA）標品、兒茶素（C）標品、表沒食子酸兒茶素（EGC）標品、表兒茶素（EC）標品、1, 4, 6-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖（G-G）標品、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）標品、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）標品（天津一方科技有限公司）。

1.1.3 主要儀器與設備

粉末顏色值中L*、b*、ΔE*ab值與姜黃素類各成分的含量均呈現極顯著的負相關關系，a*值與姜黃素類各成分的含量均呈現極顯著的正相關關系。

高效液相色譜儀1200（美國Agilent公司）；電子分析天平AR-1140（上海奧豪斯儀器有限公司）；數顯恒溫水浴鍋HH-S28S（金壇市大地自動化儀器廠）；電熱鼓風恒溫干燥箱101A-2（上海市崇明實驗儀器廠）；實驗室蒸餾水機（上海和泰儀器有限公司）；高速多功能粉碎機CS-2000（武義海納電器有限公司）。

表1 試驗樣品采摘信息表

圖1 茶葉樣品圖

1.2 方法

1.2.1 HPLC法花青素測定

1.2.1.1 樣品制備

稱取磨碎茶粉0.200 g于100 mL圓底燒瓶中，加入提取液（鹽酸甲醇）20 mL，超聲振蕩30 min，在95℃水中水浴1 h，待冷卻后，過濾在25 mL容量瓶中，重復提取2次，定容至25 mL，混勻，用0.2 μm濾膜過濾，上機，進行測定。

1.2.1.2 色譜條件

參照NY/T 2640—2014植物源性食品中花青素的測定-高效液相法[8]。色譜柱，Agilent porshell 120 ECC18（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）；流動相A為0.1%甲酸；流動相B為0.1%甲酸和乙腈；檢測波長530 nm；流速0.8 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量5 μ L；HPLC洗脫程序為：0～25 min，B液從12%線性梯度增加至35%；25～25.5 min，B液從35%線性梯度增加至18%；11～25 min，B液從18%線性梯度增加至60%；25～27 min，B液由60%線性梯度增加至80% B；25.5～29.5 min，B液保持在80%；29.5～29.9 min，B液由80%降低至12%；30 min程序停止；以12% B液后運行平衡6 min。

1.2.2.1 樣品制備

稱取0.50 g茶樹花茶磨碎樣品，加入2%磷酸10 mL，加入10 mL甲醇，混合靜置1 h，過濾于50 mL容量瓶，重復提取2次，定容至50 mL，混勻，用0.45 μm有機膜過濾，上機檢測，每個樣品重復提取2次，每個提取液重復測定3次。

1.2.2.2 色譜條件

參照建立的同時測定茶葉兒茶素、咖啡堿、沒食子酸方法，應用HPLC測定茶樣中兒茶素、咖啡堿內含物的含量。色譜柱為Tskgel ODs-80TM4.6 nm×250 mm，流動相A為0.261%磷酸與5%乙腈水溶液，流動相B為0.261%磷酸與80%乙腈水溶液，柱溫40 ℃，檢測波長280 nm，進樣量2 μL；HPLC洗脫程序為：0～25 min，B液從10%線性梯度增加至75%；25.5～29.5 min，B液從75%線性梯度增加至100%；25.5～29.5 min，B液保持在100%；29.5～29.9 min，B液由100%降低至10%；30 min程序停止；以10% B液后運行平衡6 min。

1.3 數據處理

每個樣品重復提取2次，每個提取液重復測定3次。以Mean±SD表示；應用SPSS 22進行方差分析，按照Duncan（D）進行兩兩比較，p＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 花青素的測定與比較

將提取的花青素上機檢測后，測到6個樣品中的6個花青素：天竺葵色素（Pelargonidin，Pg）、飛燕草色素（Delphinidin，Dp）、矢車菊色素（Cyanidin，Cy）、錦葵色素（Malvidin，Mv）、牽?；ㄉ兀≒etunidin，Pt）和芍藥色素（Peonidin，Pn）；檢測色譜圖如圖2，數據結果如表2和圖3。

圖2 HPLC測定花青素色譜圖

表2 樣品花青素含量測定 mg/g

圖3 花青素含量比較

分析數據發現一芽三葉樣品中花青素含量比較為：紅紫芽3號（4.89±0.32 mg/g）顯著高于其他（p＜0.05），紅紫芽3號＞紫娟＞紅紫芽2號＞紅紫芽1號；成熟葉片中紅紫芽4號（8.54±0.10 mg/g）顯著高于紅紫芽5號（6.31±0.15 mg/g），且顯著高于一芽三葉樣品（p＜0.05）；測定發現矢車菊素顯著高于飛燕草色素、天竺葵色素及其他花青素。

2.2 兒茶素的測定與比較

將提取的兒茶素上機檢測后，測到了6個樣品中8個成分：表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸脂（ECG）、表兒茶素（EC）、兒茶素（C）、沒食子酸（GA）、1, 4, 6-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖（GG）和咖啡堿（CA）；高效液相色譜檢測色譜圖如圖4，檢測結果如表3、表4、圖5和圖6。

表3 樣品中兒茶素的含量測定 mg/mL

數據分析發現一芽三葉樣品中兒茶素含量比較為：紅紫芽1號（84.18±9.58 mg/g）顯著高于其他樣品（p＜0.05），紅紫芽1號＞紫娟＞紅紫芽2號＞紅紫芽3號；成熟葉片中紅紫芽4號（44.93±2.10 mg/g）高于紅紫芽5號（39.83±3.39 mg/g），且顯著低于一芽三葉樣品（p＜0.05）；測定發現6個樣品兒茶素中簡單兒茶素的含量都低于酯型兒茶素含量。

圖4 HPLC測定兒茶素、GA 、GG 、CA色譜圖

圖5 兒茶素含量比較

表4 樣品GA、CA、GG含量測定 mg/g

圖6 CA、GA、GG的含量比較

結果表明，一芽三葉樣品中，紅紫芽1號的GA含量（0.93±0.06 mg/g）顯著高于其他樣品；GG含量最高的是紅紫芽3號，達（5.05±0.82 mg/g）顯著高于其他樣品（p＜0.05）；CA含量最高的是紅紫芽1號，達18.10±1.19 g高于其他樣品。成熟葉片的GA、GG、CA含量均顯著低于一芽三葉樣品（p＜0.05）。

3 討論

高效液相色譜分析表明在紅紫芽1號中沒有檢測到牽牛花色素，錦葵色素，其余紅紫芽都檢測到植物中常見的天竺葵色素（Pg）、飛燕草色素（Dp）、矢車菊色素（Cy）、錦葵色素（Mv）、牽?；ㄉ兀≒t）和芍藥色素（Pn）6種主要的花青素，花青素單體顯著高的是矢車菊色素，在不同紫化程度中顯著增加（p＜0.05），飛燕草色素其次含量高，這可能是紅紫芽紫色加深的主要因素。

茶樹中兒茶素是主要的多酚化合物，在試驗中，紅紫芽1號總兒茶素顯著高于其他樣品（p＜0.05），而紫娟和紅紫芽2和3號沒有顯著差異，紅紫芽4和5號沒有顯著差異，這與其花青素積累多，兒茶素積累少的分布模式總體相似，部分存在差異。酯型兒茶素在紫娟和紅紫芽1、2、3號中顯著高于紅紫芽4、5號，提示紅紫芽4和5號花青素是否較多地轉化為兒茶素；而簡單兒茶素（C）整體積累較少，研究尚未闡明原因，這可能受其他調節因子的影響。

試驗表明沒食子酸含量與兒茶素含量分布模式相似，這可能表明是酯型兒茶素含量高的重要原因?？Х葔A的生物合成與花青素分布模式相似，在紫化程度高的紅紫芽茶中含量較低，這與Kerio等[20]研究相一致?？s合單寧（GG）在紅紫芽4、5、6號中含量顯著高于其他樣品，這可能為提供花青素積累存在影響。

茶葉中內含物質的形成與外界環境密切相關，受光照，溫度，土壤及生物脅迫等的影響，同時受結構基因，功能基因和激素等調控，樣品采摘是在9月下旬進行，都是在一個季節完成，試驗所得數據只能代表當季，所得結論存在偶然性，應繼續分析每個季節樣品化學物質含量，以便綜合篩選優質資源，同時為花青素與兒茶素積累機制提供化合物含量方面的參考數據。紅紫芽茶富含花青素，有望開發成為特種茶，因此分析同一資源圃的6個不同紅紫芽茶兒茶素、花青素和咖啡堿等化學成分含量，有望發現花青素含量高的優質紅紫芽茶樹種質資源庫，為今后培育優質茶葉品種奠定良好基礎。

4 結論

試驗測定比較6個紅紫芽茶樣品的花青素、兒茶素和咖啡堿等化合物，發現紅紫芽3、4和5號花青素含量顯著高于紫娟，這些紫色茶樹資源將是花青素富集的健康茶飲料的潛在原材料，具有一定開發潛力，值得繼續研究。