響應(yīng)面法優(yōu)化高脂酸奶發(fā)酵工藝及其品質(zhì)分析

朱靜靜，張紅彩，趙存朝，黃艾祥，王雪峰，2*，陳越

1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院（昆明 650201）；2. 云南省畜產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心（昆明 650201）；3. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所（昆明 650223）

發(fā)酵乳制品以其特有的營(yíng)養(yǎng)及保健功能深受大眾喜愛(ài)，含有人體需要的各種營(yíng)養(yǎng)成分，比鮮奶更容易吸收[1]。近些年，低脂酸奶熱度漸減，而享受型全脂酸奶正在回歸，具有醇厚口感、飽腹感的全脂酸奶更是受到廣大消費(fèi)者的青睞。高脂酸奶是以生鮮牛乳為原料，奶油和乳清蛋白粉等為輔料，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵而成。其中，乳清蛋白粉的加入可提高蛋白質(zhì)含量，改善其風(fēng)味和質(zhì)地，以及減少乳清析出而延長(zhǎng)保質(zhì)期[2-4]；奶油的添加還可以改善高脂酸奶的感官品質(zhì)，快速補(bǔ)充能量，增加飽腹感[5-6]。該產(chǎn)品可直接食用或涂于面包、蛋糕和焙烤類食物上食用，有望成為酸性奶油的替代品。

試驗(yàn)在不影響奶油口感和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的前提下，將奶油添加到鮮牛乳中，與乳清蛋白粉、蔗糖等輔料互配進(jìn)行發(fā)酵，經(jīng)過(guò)特定的發(fā)酵工藝制成高脂酸奶。以感官評(píng)分值為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化高脂酸奶的最佳發(fā)酵工藝條件，并對(duì)其進(jìn)行品質(zhì)分析，為后續(xù)該產(chǎn)品的生產(chǎn)應(yīng)用提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 試驗(yàn)材料

生鮮牛乳、淡奶油、白砂糖、三花調(diào)制乳、乳清蛋白粉（WPC35），均為市售。

1.1.2 菌株與培養(yǎng)基

CICC 6063嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、CICC 6064瑞士乳桿菌（Bulgaria lactobacillus），購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心；MRS培養(yǎng)基、MRS肉湯，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

SVJ-358型智能型酸奶機(jī)，北京世紀(jì)陽(yáng)光有限公司；STARER 3100型pH計(jì)，奧豪斯儀器有限公司；JJ-05725型均質(zhì)機(jī)，廊坊通用機(jī)械制造公司；SGK-2 LB型低噪音空氣泵，北京東方精華苑科技有限公司；XS-402型脂肪測(cè)定儀，南京光學(xué)有限公司；KDY-9810型凱氏定氮儀，北京電子技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵菌種活化及配比

分別取適量乳桿菌菌株凍干粉進(jìn)行3次活化得到菌懸液，將活化后的乳酸菌接種到原料乳中馴化增殖，依次調(diào)整菌種接種量為3%（0.3×106CFU/mL）、4%（0.4×106CFU/mL）、5%（0.5×106CFU/mL），37℃恒溫培養(yǎng)至凝乳，反復(fù)傳代，以達(dá)到試驗(yàn)要求，保證菌種活力能在4 h內(nèi)凝乳。選取活性最強(qiáng)的嗜熱鏈球菌和瑞士乳桿菌以4%的接種量按（1∶1，1∶2，1∶3，2∶1和3∶1）5種配比進(jìn)行復(fù)配，以感官評(píng)分為指標(biāo)，確定高脂酸奶發(fā)酵菌種的最佳配比。

1.2.2 高脂酸奶發(fā)酵工藝流程

鮮牛乳→添加配料→攪拌混勻→65 ℃預(yù)熱→二次均質(zhì)（5～8 MPa、9～10 MPa各均質(zhì)一次）→85 ℃殺菌30 min→冷卻至40～45 ℃→接種乳酸菌發(fā)酵劑→灌裝→30 ℃條件下恒溫發(fā)酵35 h→放入2～4 ℃冰箱冷藏24 h

1.2.3 感官評(píng)分

參照GB/T 15691—2008[7]，隨機(jī)抽取20瓶樣品，在自然光線下，用肉眼觀其色澤，聞其香味，并取少許放入舌尖，涂布滿口，品嘗其滋味，具體感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 高脂酸奶感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.4 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

以感官評(píng)價(jià)為評(píng)分指標(biāo)，分別考察發(fā)酵溫度（25，30，35，40和45 ℃）、乳清蛋白粉添加量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%，1.4%，1.6%，1.8%和2.0%）、發(fā)酵劑添加量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，2%，3%，4%和5%）、奶油與生鮮牛乳體積比（1∶0.5，1∶1，1∶1.5，1∶2和1∶2.5）、蔗糖添加量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，12%，14%，16%和18%）、發(fā)酵時(shí)間（20，25，30，35和40 h）、后熟時(shí)間（12，24，36，48和60 h）7個(gè)因素對(duì)高脂酸奶感官品質(zhì)產(chǎn)生的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取奶油與鮮牛乳的體積比（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）、后熟時(shí)間（D）4個(gè)因素，以感官評(píng)分值為響應(yīng)值，通過(guò)響應(yīng)面分析方法優(yōu)化高脂酸奶的制備工藝，分析水平見(jiàn)表2。

1.2.6 高脂酸奶的理化指標(biāo)、乳酸菌活菌數(shù)測(cè)定

1.2.6.1 pH

采用防水型pH微測(cè)試筆。

1.2.6.2 酸度

參照GB 5413.34—2016[8]。

1.2.6.3 持水力

參照盧孝潔等[9]的方法。

1.2.6.4 蛋白質(zhì)

參照GB 5009.5—2016[10]。

1.2.6.5 脂肪

參照GB 5009.6—2016[11]。

1.2.6.6 乳酸菌活菌數(shù)

參照GB/T 1634—1996[12]。

1.2.7 高脂酸奶的氨基酸測(cè)定

1.2.7.1 樣品處理及其衍生

參照王逍君等[13]的方法并進(jìn)行修改。準(zhǔn)確稱取2 g酸奶，置于20～30 mL安瓿瓶中，加入10 mL含0.1%苯酚的6 mol/L鹽酸，振搖使酸奶溶解或使酸奶均勻分散于溶液中，將安瓿瓶置于-20 ℃冰箱中冷凍3～5 min，充氮后用噴燈熔封，然后置于110 ℃左右的烘箱中水解24 h，取出冷卻，取水解液1 mL，置于濃縮儀中濃縮至干（或用氮?dú)獯蹈扇コ}酸），加入1 mL的0.1 mol/L稀HCl溶解，再用0.45 μm濾膜過(guò)濾。

參照王雪峰等[14]的方法并進(jìn)行修改。準(zhǔn)確量取氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品水解液200 μL，分別置于1.5 mL離心管中，往每個(gè)離心管中準(zhǔn)確加入正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，每個(gè)離心管中分別加入三乙胺乙腈溶液100 μL、異硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL，混勻，室溫放置1 h，然后加入正己烷400 μL至各離心管，振搖后放置10 min，取下層溶液（PTC-AA），用0.45 μm針式濾器過(guò)濾，取濾液200 μL，加800 μL水稀釋，搖勻，待測(cè)。

1.2.7.2 樣品測(cè)定

色譜條件：Venusil AA氨基酸分析柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL；波長(zhǎng)254 nm；流速1.0 mL/min。流動(dòng)相A：稱取15.2 g無(wú)水乙酸鈉，加水1 850 mL，溶解后用冰醋酸調(diào)pH至6.5，然后加乙腈140 mL，混勻，用0.45 μm濾膜過(guò)濾。流動(dòng)相B：80%乙腈溶液。

洗脫梯度如表3所示。

表3 流動(dòng)相洗脫梯度

1.2.7.3 結(jié)果計(jì)算

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間定性，內(nèi)標(biāo)法定量。

式中：f1為樣品溶液中各氨基酸峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積；f2為混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中各氨基酸峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面；C為氨基酸對(duì)照品，μ g/mL。

式中：V為樣品溶液的定容體積，mL；W為樣品質(zhì)量，g。

1.2.8 高脂酸奶產(chǎn)香能力的測(cè)定

參照李婭等[15]方法測(cè)定后熟24 h、pH 3.32的高脂發(fā)酵乳中的乙醛、丁二酮含量，評(píng)價(jià)其產(chǎn)香能力。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品至少3次重復(fù)數(shù)據(jù)，以平均值（AV）±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。通過(guò)SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差顯著性分析，p＜0.05時(shí)表示差異顯著。最小顯著差異法用于數(shù)據(jù)多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高脂酸奶發(fā)酵菌種的確定

由圖1可知，嗜熱鏈球菌和瑞士乳桿菌比例為1∶2時(shí)感官評(píng)分值最高；嗜熱鏈球菌在發(fā)酵過(guò)程中主要產(chǎn)生乳酸和葉酸，增加酸奶黏度，可縮短酸奶凝乳時(shí)間，而瑞士乳桿菌則產(chǎn)生大量乳酸和特殊香味物質(zhì)[16]。因此，選取嗜熱鏈球菌與瑞士乳桿菌比例1∶2為最佳的發(fā)酵菌種復(fù)配比例。

圖1 菌種發(fā)酵劑比例對(duì)高脂酸奶感官品質(zhì)的影響

2.2 高脂酸奶發(fā)酵工藝單因素試驗(yàn)

2.2.1 奶油與生鮮牛乳體積比對(duì)高脂酸奶感官品質(zhì)的影響

由圖2可得知，隨著奶油與生鮮牛乳體積比的增加，高脂酸奶產(chǎn)品的感官評(píng)分值出現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。比例過(guò)高過(guò)低都會(huì)導(dǎo)致感官評(píng)分值降低，比例過(guò)低酸奶的凝固狀態(tài)和風(fēng)味不足，比例過(guò)高則有大量脂肪上浮，影響產(chǎn)品狀態(tài)。因此，選取奶油與生鮮牛乳體積比1∶1.5為最佳比例。

圖2 奶油與生鮮牛乳體積比對(duì)高脂酸奶感官品質(zhì)的影響

2.2.2 蔗糖、發(fā)酵劑、乳清蛋白粉添加量對(duì)高脂酸奶感官品質(zhì)的影響

江岸區(qū)位于武漢市中心地帶，是武漢市委、市政府所在地，轄區(qū)面積70.25平方公里，戶籍人口71.11萬(wàn)，常住人口100余萬(wàn)，為居民日常生活供應(yīng)蔬菜的農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)現(xiàn)有36家，蔬菜農(nóng)藥殘留的多少直接決定了居民餐桌飲食安全與否。把握源頭是食品安全監(jiān)管的關(guān)鍵，降低居民餐桌飲食風(fēng)險(xiǎn)，必須緊緊抓住蔬菜農(nóng)殘檢測(cè)這個(gè)“牛鼻子”。

由表4可知，蔗糖添加量、發(fā)酵劑添加量、乳清蛋白粉添加量質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為16%，3%和1.6%時(shí)感官品質(zhì)達(dá)到最好。蔗糖可為人體增加能量、增加酸甜口感、縮短發(fā)酵時(shí)間，添加量過(guò)少會(huì)影響發(fā)酵效果，添加過(guò)多酸甜味不協(xié)調(diào)，嚴(yán)重影響口感[17]；發(fā)酵劑可為牛乳提供益生菌，但是過(guò)高會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定的危害，過(guò)低則發(fā)酵不完全[18]；乳清蛋白粉的加入可提高酸奶蛋白質(zhì)含量，提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，增強(qiáng)其持水性[4]。

表4 蔗糖、發(fā)酵劑、乳清蛋白粉添加量對(duì)高脂酸奶感官品質(zhì)的影響

2.2.3 發(fā)酵溫度對(duì)高脂酸奶感官品質(zhì)的影響

由圖3可知，高脂酸奶發(fā)酵過(guò)程中隨著溫度逐漸提高，感官評(píng)分呈先上升后下降的趨勢(shì)，30 ℃時(shí)的感官評(píng)分最高，可能是由于隨著發(fā)酵溫度的提高，使乳蛋白變性，使高脂酸奶產(chǎn)生怪味或異味，影響感官評(píng)分。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)高脂酸奶感官品質(zhì)的影響

2.2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)高脂酸奶品質(zhì)的影響

由圖4可以看出，發(fā)酵時(shí)間達(dá)到35 h時(shí)感官評(píng)分值達(dá)到最高，之后逐漸下降。發(fā)酵時(shí)間過(guò)短時(shí)，乳蛋白的交互結(jié)構(gòu)形成不充分，不能包裹乳中原有的水分使乳清大量析出[19]；發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，酸奶凝乳較好，無(wú)乳清析出，但長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵導(dǎo)致乳酸菌大量繁殖，菌種大量損耗，影響其風(fēng)味[20]。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)高脂酸奶感官品質(zhì)的影響

2.2.5 后熟時(shí)間對(duì)高脂酸奶感官品質(zhì)的影響

由圖5可知，隨著后熟時(shí)間的延長(zhǎng)，感官評(píng)分呈先上升后下降的趨勢(shì)，后熟24 h的感官評(píng)分最高，可能由于隨著發(fā)酵乳后熟過(guò)程中時(shí)間的延長(zhǎng)，高脂發(fā)酵乳中的風(fēng)味物質(zhì)被損耗或轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，導(dǎo)致感官品質(zhì)受到影響。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，建立Box-Behnken Design中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)?zāi)Ｐ停ㄟ^(guò)擬合二次方程計(jì)算最優(yōu)工藝組合。選擇奶油與生鮮牛乳體積比（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）、后熟時(shí)間（D）四因素三水平響應(yīng)平面試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

圖5 后熟時(shí)間對(duì)高脂酸奶感官品質(zhì)的影響

表5 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

利用軟件對(duì)表6進(jìn)行多元回歸擬合，得到高脂發(fā)酵乳感官評(píng)分對(duì)奶油與生鮮牛乳體積比（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）、后熟時(shí)間（D）的二次方程模型為：Y=61.33+5.52A-0.53B-3.87C-1.2D-6.13AB-1.47AC+1.8AD+1.47BC+1.16BD-5.07CD+5.59A2+2.32B2-3.75C2+1.53D2。

回歸模型的方差分析結(jié)果見(jiàn)表6。

表6方差分析可知：回歸模型顯著性檢驗(yàn)p=0.000 5＜0.01，說(shuō)明二次多元回歸模型極顯著；感官評(píng)分回歸模型失擬性檢驗(yàn)p=0.096 9＞0.05，可認(rèn)為二次回歸模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合性充分模型失擬不顯著。CV表示試驗(yàn)本身的精度，CV值越小，試驗(yàn)的可靠性越高，試驗(yàn)中CV比較低，為5.68%。

表6 感官評(píng)分回歸模型方差分析

綜上所述，回歸模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，說(shuō)明試驗(yàn)操作可信度高，具有一定的實(shí)用性指導(dǎo)意義。各因素的F值越大，說(shuō)明影響越顯著[21]，以上模型可看出各因素對(duì)高脂酸奶感官品質(zhì)影響的順序?yàn)椋海ˋ）奶油與生鮮牛乳體積比＞（C）發(fā)酵時(shí)間＞（D）后熟時(shí)間＞（B）發(fā)酵溫度。

2.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析

通過(guò)觀察圖6中響應(yīng)面的變化情況和等高線的稀疏程度可直觀地反映奶油與生鮮牛乳體積比（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）、后熟時(shí)間（D）交互作用對(duì)高脂酸奶感官品質(zhì)的影響，當(dāng)響應(yīng)面圖呈橢圓形或馬鞍形時(shí)，表示兩因素交互作用顯著[22]。

圖6和圖7為有二次回歸方程擬合得到的響應(yīng)值Y的等高線及三維曲面圖，是回歸方程的形象描述。由等高線圖可知，A與B，C與D之間成馬蹄形，說(shuō)明交互作用顯著（p＜0.05）。奶油與生鮮牛乳體積比響應(yīng)面坡度較發(fā)酵溫度的陡峭，說(shuō)明其對(duì)高脂酸奶感官品質(zhì)的影響比發(fā)酵溫度大；發(fā)酵時(shí)間坡度比后熟時(shí)間的陡峭，說(shuō)明發(fā)酵時(shí)間對(duì)高脂酸奶感官品質(zhì)的影響比后熟時(shí)間大。結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

圖6 奶油與生鮮牛乳體積比（A）、發(fā)酵溫度（B）對(duì)感官評(píng)分的影響

圖7 發(fā)酵時(shí)間（C）、后熟時(shí)間（D）時(shí)間對(duì)感官評(píng)分的影響

2.3.4 最佳條件的確定和回歸模型的驗(yàn)證

由表7可知回歸模型通過(guò)響應(yīng)面法得到高脂發(fā)酵乳工藝條件為高脂酸奶的最佳發(fā)酵工藝為：奶油與生鮮牛乳體積比1∶1.5、糖的添加量16.4%、乳清蛋白粉添加量1.6%、發(fā)酵劑的添加量3%、發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時(shí)間35 h、后熟時(shí)間24 h。此時(shí)感官評(píng)分值為88.15。考慮實(shí)際操作情況與設(shè)備參數(shù)狀況，將糖的添加量調(diào)整為16%，在上述最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到高脂發(fā)酵乳感官評(píng)分平均值為87.12，與理論值接近，說(shuō)明該回歸模型得到的優(yōu)化參數(shù)準(zhǔn)確性高。

表7 最佳條件的確定和回歸模型的驗(yàn)證

2.3.5 高脂酸奶的理化指標(biāo)、乳酸菌活菌數(shù)測(cè)定

在最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下，測(cè)定高脂酸奶產(chǎn)品的的理化指標(biāo)、乳酸菌活菌數(shù)，見(jiàn)表8。

由表8可知，此工藝條件下得到的高脂酸奶產(chǎn)品質(zhì)量符合發(fā)酵乳的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。其中，蛋白質(zhì)含量是普通酸奶含量的2倍，脂肪含量幾乎是普通酸奶的4倍（普通酸奶脂肪含量在3.0 g/100 g左右）。因此，該產(chǎn)品可作為酸性奶油的替代品，且風(fēng)味優(yōu)于普通酸奶。

表8 高脂酸奶的理化指標(biāo)、乳酸菌數(shù)測(cè)定

2.3.6 高脂酸奶中氨基酸種類及含量分析

圖8 17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖9 普通酸奶樣品氨基酸色譜圖

圖10 高脂酸奶樣品氨基酸色譜圖

表9 普通酸奶與高脂酸奶樣品中氨基酸含量比較

由表9可以看出，普通酸奶（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌為發(fā)酵菌種，鮮牛乳為原料，白糖添加量8%、發(fā)酵溫度43 ℃、發(fā)酵時(shí)間8 h）與高脂酸奶的氨基酸種類及含量存在較大差異，高脂酸奶氨基酸組成中精氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸含量明顯高于普通酸奶，但氨基酸總量（0.021 0%）要低于普通酸奶氨基酸總量（0.039 4%），主要是由于高脂酸奶加工原料中鮮牛乳含量小于普通酸奶，經(jīng)過(guò)低溫長(zhǎng)時(shí)發(fā)酵，氨基酸損耗較大，氨基酸可能被消耗或者轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)[23]。

2.3.7 高脂酸奶產(chǎn)香能力的測(cè)定

乙醛和丁二酮是構(gòu)成發(fā)酵乳風(fēng)味的主要成分，賦予發(fā)酵乳特殊的香味[15]。高脂酸奶在后熟24 h階段，測(cè)得其乙醛、丁二酮含量較高，分別為60.06和34.68 mg/L，是賦予該產(chǎn)品特殊酪香味的主要原因。

3 結(jié)論

試驗(yàn)通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，確定了高脂酸奶的最佳發(fā)酵工藝條件為：菌嗜熱鏈球菌與瑞士乳桿菌按1∶2的菌株比例復(fù)配、4%的接種量，奶油與生鮮牛乳體積比1∶1.5、糖的添加量16%、乳清蛋白粉添加量1.6%、發(fā)酵劑添加量3%、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)間35 h、后熟時(shí)間24 h。此條件下所得產(chǎn)品凝固性好、口感爽滑、酸甜適中、飽腹感足、具有特殊的酪香味，產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量4.24 g/100 g、脂肪含量12.26 g/100 g、滴定酸度90.7 °T、乳酸菌活菌數(shù)達(dá)1.86×106CFU/mL、乙醛與丁二酮含量分別為60.06和34.68 mg/L。所得產(chǎn)品成本低于現(xiàn)售淡奶油產(chǎn)品，有望成為酸性奶油的替代品。