大孔樹脂初步純化美洲合歡花花色苷

余亞選，秦飛，陳仲巍，紀美茹

廈門醫(yī)學(xué)院（廈門 361023）

美洲合歡花（Calliandra haematocephala）又名朱櫻花、美蕊花，除作為綠化觀賞植物外[1]，還具有一定的藥效。現(xiàn)代研究表明，美洲合歡葉中含有黃酮及其苷類、苯丙素類、4, 5-二羥基-1-哌啶酸等化合物，這些提取物具有抗氧化、抗炎、殺菌等作用[2-4]。通過前期研究[5]，發(fā)現(xiàn)美洲合歡花富含大量花色苷。

花色苷是花青素與糖類物質(zhì)以糖苷鍵結(jié)合的一類化合物，廣泛存在于自然界中的蔬菜、水果等植物中。花色苷具有一系列生物活性，可抗氧化[6-7]、消除自由基、延緩衰老、抗炎、抗腫瘤[8-9]、降低血糖[10]、增強人體免疫功能等[11]，國內(nèi)外將其應(yīng)用到食品、化妝品、藥品等多個領(lǐng)域。由于植物經(jīng)過溶劑浸提法提取得到的花色苷通常含有糖、蛋白質(zhì)及其他非花色苷類等雜質(zhì)，這會影響花色苷的性質(zhì)和應(yīng)用，因此提取純化活性花色苷類物質(zhì)對于保健食品及藥物的研發(fā)具有重要的現(xiàn)實意義。大孔吸附樹脂是一類有機高分子聚合物吸附劑，通過吸附性和分子篩原理將具有一定極性的有機大分子物質(zhì)進行分離。與現(xiàn)有的天然色素分離方法相比，因其具有吸附量大、吸附速度快、洗脫率高且能夠再生使用等優(yōu)點，因此被廣泛應(yīng)用于酚類、黃酮、色素等物質(zhì)的吸附純化研究中[12-14]。

文獻檢索未見美洲合歡花花色苷的相關(guān)研究報道，因此試驗對美洲合歡花花色苷進行提取、純化，對比8種大孔樹脂對美洲合歡花花色苷純化效果，重點研究大孔樹脂D101純化花色苷工藝，為美洲合歡花資源的發(fā)展、評價及利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

美洲合歡花，采摘于福建廈門集美區(qū)灌口鎮(zhèn)，經(jīng)廈門醫(yī)學(xué)院鮑紅娟副教授鑒定為豆科植物美洲合歡（Calliandra haematocephala）花冠；鹽酸、無水乙醇、氫氧化鈉、乙腈、甲酸等（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分析純）；大孔樹脂D101、AB-8、HPD-100、HPD-100A、HPD-200A、HPD-300、HPD-500、HPD-600（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）。

N-1210B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EYELA）；SQP型電子分析天平、PB-10型pH計（德國賽多利斯儀器有限公司）；UV-1780型紫外-可見分光光度儀、Nexera X2 LC-30AD型高效液相色譜儀、Shim-pack XR-ODS Ⅲ色譜柱（75 mm×2.0 mm，1.6 μ m）（島津）。

1.2 試驗方法

1.2.1 花色苷的提取[5]

預(yù)處理：采摘后60 ℃烘干過夜，粉碎機進行磨粉處理，過40目篩，于干燥器中避光保存?zhèn)溆谩?zhǔn)確稱取1.000 g樣品加入70 mL 60%乙醇溶液，通過6 mol/L鹽酸溶液調(diào)至pH 2.0，于60 ℃水浴中回流60 min，抽濾，取濾液稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，用紫外可見分光光度計于400～800 nm下進行光譜掃描，確定美洲合歡花色苷的最大吸收波長。將濾液置于40 ℃下真空濃縮，旋蒸至干后，冷凍干燥得到花色苷粗提樣品，密封，避光下至于5 ℃冰箱中冷藏備用。

1.2.2 大孔樹脂的篩選

1.2.2.1 大孔樹脂的預(yù)處理

將大孔樹脂D101、AB-8、HPD-100、HPD-100A、HPD-200A、HPD-300、HPD-500、HPD-600用95%乙醇浸泡過夜使其充分溶脹后，倒去上層液體，用蒸餾水洗至無醇味，依次用5% NaOH溶液浸泡后蒸餾水洗至中性，5% HCl溶液浸泡后蒸餾水洗至中性，備用。

1.2.2.2 大孔樹脂的靜態(tài)吸附率和解吸率比較測試

準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的8種供試大孔樹脂各1.000 g（使用前用濾紙吸干樹脂表面的水分）于錐形瓶中，加入25 mL美洲合歡花花色苷粗提液（質(zhì)量濃度1.5 mg/mL、pH 2.0），在25 ℃、150 r/min水浴條件下振蕩24 h至吸附平衡后過濾，測定濾液中花色苷吸光度，計算各樹脂的吸附率。向吸附平衡樹脂加入60%乙醇25 mL（鹽酸調(diào)pH 2.0），振蕩24 h后過濾，測定濾液中的花色苷吸光度，計算解吸率。

式中：A0為吸附前花色苷溶液吸光度；A1為吸附后花色苷溶液吸光度；A2為解吸后花色苷溶液吸光度。

1.2.3 大孔樹脂D101靜態(tài)吸附及解吸試驗

1.2.3.1 吸附平衡時間的測定

準(zhǔn)確稱取5.000 g大孔樹脂D101于錐形瓶中，加入125 mL美洲合歡花花色苷粗提液（質(zhì)量濃度1.5 mg/mL、pH 2.0），在25 ℃、150 r/min水浴條件下振蕩，每隔0.5 h取樣測定溶液吸光度，計算吸附率。

1.2.3.2 解吸平衡時間的測定

準(zhǔn)確稱取吸附飽和樹脂5.000 g于錐形瓶中，加入pH 2.0，60%乙醇溶液125 mL，在25 ℃水浴條件下振蕩，每隔0.5 h取樣測定溶液吸光度，計算解吸率。

1.2.3.3 上樣濃度對大孔樹脂吸附能力的影響

準(zhǔn)確稱取6份1.000 g大孔樹脂D101于錐形瓶中，分別加入質(zhì)量濃度為0.50，0.75，1.00，1.25，1.50，1.75，2.00，2.25和2.50 mg/mL（鹽酸調(diào)pH 2.0）花色苷粗提液25 mL，在25 ℃、150 r/min水浴振蕩4 h至吸附平衡后抽濾，測定濾液中花色苷吸光度，計算吸附率。

1.2.3.4 溶液pH對大孔樹脂吸附能力的影響

準(zhǔn)確稱取6份1.000 g大孔樹脂 D101于錐形瓶中，分別加入pH 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0和6.0花色苷粗提液25 mL（質(zhì)量濃度1.5 mg/mL），在25 ℃、150 r/min水浴條件下振蕩4 h至吸附平衡后抽濾，測定濾液中花色苷吸光度，計算吸附率。

1.2.3.5 乙醇濃度對大孔樹脂解吸能力的影響

準(zhǔn)確稱取6份吸附飽和樹脂1.000 g于錐形瓶中，分別加入30%，40%，50%，60%，70%和80%乙醇溶液（鹽酸調(diào)pH 2.0）25 mL，在25 ℃、150 r/min水浴條件下振蕩6 h后測定溶液吸光度，計算解吸率。

1.2.3.6 溶液pH對大孔樹脂解吸能力的影響

準(zhǔn)確稱取6份吸附飽和樹脂1.000 g于錐形瓶中，分別加入pH 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0和6.0的60%乙醇溶液25 mL，在25 ℃水浴條件下振蕩6 h后測定溶液吸光度，計算解吸率。

1.2.4 大孔樹脂D101動態(tài)吸附及解吸試驗

1.2.4.1 上樣流速對大孔樹脂吸附和能力的影響

稱取一定量樹脂D101，濕法裝柱，用恒流泵控制不同的流速（1，2和3 mL/min），使花色苷粗提液上柱吸附，用自動部分收集器以每管10 mL收集流出液，流出液在530 nm波長處吸光度達到花色苷原液吸光度的10%時，記錄泄漏點（V，mL）。

1.2.4.2 洗脫流速對解吸率的影響

按照確定的泄漏點上樣完成后，依次分別用蒸餾水和pH 2.0的鹽酸溶液洗脫吸附柱，以便除去可溶性的糖、蛋白質(zhì)及其他小分子物質(zhì)。用pH 2.0、60%乙醇溶液以不同的速度洗脫（1，2和3 mL/min），利用自動收集器收集洗脫液，每5 mL收集1管，測定吸光度。

1.2.5 HPLC分析純化前后美洲合歡花花色苷提取物

對純化前后花色苷進行成分分析，HPLC分析條件：Shim-pack XR-ODS Ⅲ色譜柱（75 mm×2.0 mm，1.6 μm），柱溫25 ℃。流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）。梯度洗脫：0～20 min，0～50% A；20～30 min，50%～0 A。檢測波長530 nm，體積流量0.5 mL/min，進樣量10 μL，樣品濃度1 mg/mL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗進行3次重復(fù)試驗，結(jié)果取平均值，并采用Graphpad prism 6.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 美洲合歡花花色苷最大吸收波長的確定

研究表明，花色苷特征吸收峰在500～540 nm[15]。美洲合歡花400～800 nm吸收波長下的吸收光譜圖如圖1所示，美洲合歡花花色素最大吸收波長為530 nm，可見該色素為花色苷類，因此以530 nm作為檢驗波長。

圖1 美洲合歡花花色苷吸收光譜圖

2.2 大孔樹脂的篩選

8種不同的大孔樹脂分別吸附美洲合歡花花色苷粗提液（pH 2.0），吸附時間24 h；樹脂解吸條件為60%、pH 2.0的乙醇溶液。吸附和解吸平衡后結(jié)果見表1。結(jié)果表明，除HPD-100外，其他幾種樹脂的吸附能力均在90%以上，差異不大。但解吸方面，D101的解吸率最大，高達81.58%，綜合考慮，在后續(xù)試驗中采用D101樹脂。

表1 不同樹脂的吸附和解吸性能比較

2.3 大孔樹脂D101靜態(tài)吸附及解吸試驗結(jié)果

2.3.1 吸附平衡時間

由圖2可知，在前3 h過程中D101樹脂對美洲合歡花花色苷的吸附率隨著時間延長呈明顯上升趨勢，尤其是初始的1 h速率最大，吸附率達63%，隨后吸附速率逐漸降低。大約在4 h吸附率達93%，繼續(xù)增加吸附時間，吸附率基本保持穩(wěn)定，樹脂與花色苷之間的作用達到動態(tài)平衡，吸附達到飽和，因此以4 h為最佳吸附時間。

圖2 D101樹脂對花色苷的靜態(tài)吸附曲線

2.3.2 解吸平衡時間

圖3為60%酸化乙醇（pH 2.0）溶液對花色苷的解吸曲線，洗脫前2 h內(nèi)，乙醇溶液對吸附在樹脂上的花色苷解吸能力較強，解吸率增加較快，尤其在解吸30 min時，解吸率達59%。之后隨著解吸時間延長，洗脫速率降低，解吸率增加變緩。解吸3 h后，溶液中花色苷濃度基本變化不大，這是因為此時乙醇溶液、大孔樹脂對花色苷的作用達到動態(tài)平衡，解吸率變化甚微，解吸過程基本完成。因此，解吸完成時間為3 h，此時解吸率為78%。

圖3 D101樹脂對花色苷的靜態(tài)解吸曲線

2.3.3 上樣濃度對吸附率的影響

由圖4可知，D101樹脂對美洲合歡花花色苷的吸附率隨著上樣濃度增加先增大后減小，樣品質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL時，吸附率達到最大，吸附達到飽和狀態(tài)。這是因為花色苷液質(zhì)量濃度過低時，吸附時間長，且質(zhì)量濃度過低造成吸附動力小，導(dǎo)致吸附量低[16]。質(zhì)量濃度過高時，雜質(zhì)吸附率增加，與花色苷競爭吸附的分子增多，花色苷分子不能與大孔樹脂內(nèi)表面充分交換吸附，造成吸附率降低[17]。

2.3.4 吸附液pH對吸附率的影響

由圖5可知，D101大孔樹脂對美洲合歡花中花色苷的吸附率隨著樣液pH增大先增加后減小，pH 2.0時吸附效果最佳，這是因為花色苷在不同pH下有不同存在形式，酸性條件下，花色苷大多以分子形式存在，易被樹脂吸附，而隨著酸性減弱，以分子形式存在的花色苷變少，影響吸附效果[18]。因此pH 2.0為最佳樣液pH。

圖4 樣品質(zhì)量濃度對吸附效果的影響

圖5 吸附液pH對花色苷吸附效果的影響

2.3.5 洗脫劑濃度對解吸率的影響

由圖6可知，D101大孔樹脂對花色苷的解吸率隨洗脫劑乙醇體積分數(shù)的增加呈增大趨勢，乙醇體積分數(shù)60%時，解吸率達80%以上。但繼續(xù)增加乙醇體積分數(shù)，大孔樹脂對花色苷的解吸率增大很不明顯，這是因為低體積分數(shù)的乙醇溶液極性偏大，不能將大孔樹脂中的花色苷充分解吸，因此解吸效果差。但是繼續(xù)增加乙醇體積分數(shù)，大孔樹脂對花色苷的解吸率增大很不明顯，這可能是因為濃度過大會造成醇溶現(xiàn)象，不利于解吸[19-20]，再加上從成本和環(huán)境綜合因素考慮，選擇60%乙醇作為美洲合歡花花色苷的洗脫溶劑。

2.3.6 解吸液pH對解吸率的影響

由圖7可知，解吸液pH對D101吸附花色苷的解吸影響較大，pH 1.0～2.0時，解吸率有所增加，但pH繼續(xù)增加后，解吸率反而降低，pH 2.0時，解吸率最好，可能是因為pH小于2.0時，被解吸出來花色苷結(jié)構(gòu)遭到破壞，而pH大于2.0時，花色苷不能完全充分解吸，使解吸率有所下降[19]。因此選擇pH 2.0為最佳洗脫條件。

圖6 乙醇體積分數(shù)對花色苷解吸率的影響

圖7 解吸液pH對花色苷解吸效果的影響

2.4 大孔樹脂D101動態(tài)吸附及解吸

2.4.1 上樣流速對吸附效果的影響

一般認為流出液濃度為上樣初始濃度的10%時為泄漏點，此時樹脂對溶質(zhì)吸附趨向飽和。由圖8可知，隨著花色苷粗提液流出體積增加，流出液的吸光度也逐漸增加，樹脂吸附飽和，繼續(xù)增加花色苷體積，花色苷出現(xiàn)泄漏。選擇上樣質(zhì)量濃度1.5 mg/mL（吸光度A=1.414）的花色苷溶液進行進行試驗，上樣流速3 mL/min時，流出液體積310 mL時就開始出現(xiàn)泄漏，較早浪費花色苷溶液，這是因為流速過快，花色苷分子無法與樹脂充分接觸，而直接隨上樣液的流動而泄漏[20]；上樣流速1 mL/min時，流出液體積510 mL時才開始出現(xiàn)泄漏，但是考慮上樣速度過慢影響吸附效率，最終確定流速2 mL/min為佳。

圖8 上樣流速對動態(tài)吸附效果的影響

2.4.2 洗脫流速對解吸效果的影響

由圖9可知，收集洗脫液吸光度均為先增大后減小，洗脫流速1 mL/min時的吸光度峰值最大，洗脫峰相對集中，對稱性好且無明顯拖尾情況；流速3 mL/min時的吸光度峰值最小，最后降到最低值，且有拖尾現(xiàn)象，這是因為洗脫速度過快，洗脫劑來不及與樹脂充分接觸，就直接流出吸附柱。所以，洗脫流速1 mL/min時的解吸附效果最好。

圖9 洗脫流速對解吸效果的影響

2.5 HPLC檢測結(jié)果

通過使用液相色譜法對比純化前后花色苷，結(jié)果如圖10所示。結(jié)果表明，純化后的花色苷經(jīng)過高效液相色譜檢測后，雜峰變少，峰值有顯著提高，表明經(jīng)過大孔吸附樹脂純化過的花色苷純度明顯有所提高。

圖10 純化前后花色苷液相色譜圖

3 結(jié)論

通過靜態(tài)吸附-解吸試驗，對D101、AB-8、HPD-100、HPD-100A、HPD-200A、HPD-300、HPD-500和HPD-600這8種大孔樹脂進行了篩選，得到D101樹脂對美洲合歡花花色苷的吸附-解吸效果最佳。美洲合歡花花色苷吸附解吸的最優(yōu)工藝條件為：上樣質(zhì)量濃度1.5 mg/mL、pH 2.0、洗脫液采用60%酸化乙醇、上樣液流速2 mL/min、洗脫流速1 mL/min。HPLC檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過大孔吸附樹脂純化過的花色苷純度明顯有所提高。