丙酮沉淀法提取普洱茶多糖工藝的響應面分析

董亮，胡麗，馬懿

四川輕化工大學生物工程學院（自貢 643000）

茶多糖（TPS）是從茶葉中提取出的活性多糖的總稱，是在茶多酚之后發現的又一類具有生理活性的重要物質[1]。藥理研究表明，茶多糖具有降血糖、降血脂、降血壓、抗癌、抗凝血、抗血栓、抗動脈粥樣硬化、耐缺氧、防輻射、防治心血管疾病、增加冠狀動脈血流量、增加機體免疫力等多種功能，尤其是其降血脂效果和免疫活性，可望成為預防和治療糖尿病、心血管病，增加免疫功能的天然藥物，也是茶葉保健性功能理化指標之一。茶多糖是普洱茶內含物質中的關鍵物質，茶多糖在枝葉粗老、等級低的茶葉中的含量比在嫩葉中的高，其含量的高低深刻影響著普洱茶的品質[2]。

茶多糖的提取方法主要有熱水浸提法、超聲波提取法、酶提取法、醇沉淀法、丙酮沉淀法、超濾法、超臨界流體萃取法、稀酸浸提法、稀堿浸提法、CTAB沉淀法等。但目前關于普洱茶多糖的丙酮浸提工藝的研究尚未見報道，據謝愛澤等[3]采用丙酮沉淀法提取金花茶多糖的研究表明，采用丙酮沉淀法簡便、快速，具有較強的實用性，且提取效果較好。

試驗以云南普洱茶為原料，采用丙酮對茶溶液進行沉淀，選取浸提溫度、沉淀劑用量、沉淀時間及離心時間4個因素做單因素試驗，研究4個因素對茶多糖提取率的影響；在確定4個單因素中的最優水平基礎上，利用Box-Behnken設計原理，選取浸提溫度（A）、沉淀劑用量（B）、沉淀時間（C）、離心時間（D）4個因素為響應因子，以茶多糖提取率（R）為響應值，設計四因素三水平的響應面分析試驗[4]。采用試驗設計與處理軟件Design-Expert 8.0.6進行二次曲面擬合，并最終確定出丙酮沉淀法提取普洱茶多糖的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

普洱茶（購于云南）。

丙酮、無水乙醇、無水乙醚（均為分析純，重慶川東化工有限公司）。

1.2 主要儀器與設備

臺式高速離心機（RJ-TGL-1850，無錫市瑞江）；電子天平（AZ204N，常州市衡正）；中草藥粉碎機（FW177，天津市泰斯特）；電子恒溫水浴鍋（DZKW-4，北京中興偉業）。

1.3 試驗方法

1.3.1 茶多糖提取工藝流程

普洱茶中茶多糖的提取工藝流程為：普洱茶取樣→粉碎后，過60目篩→熱水浸提→離心取上清液→丙酮沉淀→離心（4 000 r/min）取沉淀→無水乙醇、丙酮、無水石油醚交替攪拌洗滌2次[5]→干燥→得粗茶多糖干品→測定提取率。

1.3.2 茶多糖提取率的測定

茶多糖提取率的計算如式（1）。

式中：m1為提取出的茶多糖質量，g；m為普洱茶原料質量，g。

1.3.3 茶多糖提取單因素試驗

選取浸提溫度（40，50，60，70和80 ℃）、沉淀劑用量（25，50，75，100和125 mL）、沉淀時間（9，12，15，18和21 h）和離心時間（5，10，15，20和25 min）4個單因子，考察對多糖提取率的影響。

1.3.4 響應面法優化提取工藝

運用BBD設計，在單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken Design試驗設計原理[7]，選取浸提溫度（A）、沉淀劑用量（B）、沉淀時間（C）、離心時間（D）4個因素為響應因子，以茶多糖提取率（R）為響應值，響應面分析試驗設計為四因素三水平，以確定最佳丙酮沉淀法提取工藝條件，如表1所示。

表1 響應面優化試驗因素水平編碼表

2 結果與討論

2.1 單因素結果

選取浸提溫度、沉淀劑用量、沉淀時間、離心時間4個單因子，考察其對多糖提取率的影響。試驗結果表明，沉淀劑用量75 mL、沉淀時間15 h、離心時間15 min、浸提溫度60 ℃時，茶多糖提取率最大。

2.2 響應曲面法優化試驗結果

2.2.1 響應模型的建立與分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件對響應面優化試驗的數據進行二次多項式回歸擬合，從而得到普洱茶茶多糖提取率（Y）對浸提溫度（A）、沉淀劑用量（B）、沉淀時間（C）、離心時間（D）的回歸模型方程為：Y=14.10-0.13A-0.13B-0.010C+0.20D+0.15AB+0.12AC-0.13AD-0.25BC-0.053BD-0.20CD-0.47A2-0.31B2-1.14C2-0.39D2。

回歸模型具有較高顯著性（p＜0.000 1），失擬項不顯著（p=0.299 0），此外分析結果中校正系數R2adj=0.995 9，R2=0.998 0。由此表明回歸模型有較好擬合度，誤差較小。因此模型可以反映響應值變化，同時回歸方程可以對丙酮沉淀法提取普洱茶茶多糖的工藝參數進行分析和預測。由回歸模型顯著性檢驗分析表可知A、B、D、AB、AC、AD、BC、CD、A2、B2、C2、D2對茶多糖提取率均有顯著的影響（p＜0.05），而未標注出的因素影響不顯著。根據F值大小可知，各因素對普洱茶茶多糖提取率影響大小順序為離心時間（D）＞沉淀劑用量（B）＞浸提溫度（A）＞沉淀時間（C），其中沉淀時間的影響最小。

2.2.2 響應面優化結果

采用Design-Expert 8.0.6軟件對響應面優化試驗的結果數據進行分析，得出回歸模型等高線圖和響應面圖。等高線的形狀反映的是因素間交互作用的強弱程度，等高線呈橢圓形或馬鞍形時表示兩因素之間的交互作用顯著，呈圓形時則表示兩因素之間的交互作用不顯著[8]。通過觀察和分析等高線的形狀及響應面曲線的坡度走勢等變化情況，可以直觀反映出所考察因素每兩者之間的交互作用對普洱茶茶多糖提取率的影響程度。其結果圖1～圖5所示。

圖1中等高線呈近似橢圓形；由響應曲面圖變化可知，沉淀時間與離心時間一定時，隨著浸提溫度增加，茶多糖提取率呈先增加后下降趨勢，曲線變化較平緩。隨著沉淀劑用量增加，茶多糖提取率呈先增加后下降趨勢，且曲線較平緩。

圖1 浸提溫度與沉淀劑用量的等高線圖與響應曲面圖

圖2 中等高線形狀呈明顯橢圓形；在響應曲面圖變化中，沉淀劑用量與離心時間一定時，隨著沉淀時間增加，茶多糖提取率呈先升高后下降趨勢，且曲線較陡。隨著浸提溫度升高，茶多糖提取率呈先增加后下降趨勢，且曲線較平緩。

圖2 浸提溫度與沉淀時間的等高線圖與響應曲面圖

圖3 中等高線形狀呈近似橢圓形；在響應曲面圖變化中，沉淀劑用量與沉淀時間一定時，隨著離心時間增加，茶多糖提取率呈先升高后趨于平緩趨勢，且曲線較陡。隨著浸提溫度增加，茶多糖提取率呈先升高后下降趨勢，且曲線較平緩。

圖3 浸提溫度與離心時間的等高線圖與響應曲面圖

圖4 中等高線形狀呈明顯橢圓形；在響應曲面圖變化中，浸提溫度與離心時間一定時，隨著沉淀時間增加，茶多糖提取率先增加后減少，且曲線較陡。隨著沉淀劑用量增加，茶多糖提取率呈先升高后趨于平緩趨勢，且曲線較平緩。

圖4 沉淀劑用量與沉淀時間的等高線圖與響應曲面圖

圖5 中等高線形狀呈近似橢圓形；在響應曲面圖變化中，浸提溫度與沉淀時間一定時，隨著離心時間增加，茶多糖提取率先增加后減少，且曲線較陡。隨著沉淀劑用量增加，茶多糖提取率也先增加后減少，且曲線較平緩。

圖6中等高線形狀呈明顯橢圓形；在響應曲面圖變化中，浸提溫度與沉淀劑用量一定時，隨著離心時間增加，茶多糖提取率先增加后幾乎不變，且曲線較陡。隨著沉淀時間增加，茶多糖提取率先增加后減少，且曲線較陡。

圖1、3、5的3D曲線最為平滑，等高線呈近似橢圓形，表明浸提溫度與沉淀劑用量、浸提溫度與離心時間、沉淀劑用量與離心時間相互之間交互作用較顯著；而圖2、4、6的3D曲線最陡，等高線呈明顯橢圓，表明浸提溫度與沉淀時間、沉淀劑用量與沉淀時間、沉淀時間與離心時間相互之間交互作用極顯著。

圖5 沉淀劑用量與離心時間的等高線圖與響應曲面圖

圖6 沉淀時間與離心時間的等高線圖與響應曲面圖

3 結論

以普洱茶為原料，采用丙酮沉淀法提取普洱茶茶多糖的方法，研究丙酮提取茶多糖工藝的最佳條件，并使用響應曲面優化提取工藝。結果表明，茶多糖提取最佳工藝條件為：浸提溫度63.81 ℃，沉淀劑用量83.72 mL，沉淀時間16.48 h，離心時間18.29 min。在茶多糖提取試驗過程中離心時間是最大影響因素。在響應面選取出的最佳條件下進行試驗，實際測得的茶多糖的平均提取率為14.155 4%，而與預測的理論值14.169 2%相比基本一致。故采用響應曲面回歸模型對丙酮沉淀法提取普洱茶茶多糖進行的工藝優化有較好效果。