響應面優化復合酶法制備杏鮑菇抗氧化物

裴云成 ，朱丹，李文香，鄭華 ，程凡升*

1. 青島農業大學食品科學與工程學院（青島 266109）；2. 青島農業大學生命科學學院（青島 266109）；3. 青島農研生物科技有限公司（青島 266109）

杏鮑菇（Pleurotus eryngii）別名刺芹側耳，菌肉肥厚，并且具有杏仁香味[1]。杏鮑菇含大量營養物質，如各種糖類、蛋白質和維生素等，還含有多種生物活性化合物，脂肪含量低，具有抗病毒、抗疲勞、抗氧化、防止動脈硬化的作用[2]。它還可降低癌癥發生幾率[3]。新鮮杏鮑菇含有大量水，容易發生褐變腐爛，不易保藏[4]，所以杏鮑菇產品的深加工技術有待于深入研究。選擇合適、實用的加工處理方法對減少新鮮杏鮑菇損失，保持良好商品性狀和營養價值具有重要意義[5]。

近年來國內外關于杏鮑菇相關產品的開發，有效成分的提取、研究及利用逐漸成為熱點[6]。而關于杏鮑菇有效成分的研究，國內外主要集中在杏鮑菇多糖和胞外酶上[7]。有張夢甜等[8]研究杏鮑菇子實體的營養含量和功能成分，暴增海等[9]研究對子實體和菌絲包含的營養物質的對比情況。楊立紅等[10]在杏鮑菇子實體的基礎上，經分離和純化得到杏鮑菇多糖。研究表明，多數杏鮑菇產品屬于粗制產品，使杏鮑菇含有的活性成分無法充分利用。杏鮑菇本身含有較多抗氧化活性物質[11]，杏鮑菇抗氧化物是近幾年來才開發的新型產品，其提取方法有水提法、堿提法、酶提法、微波提取法、超聲提取法[12]，但復合酶法提取尚鮮見報道。在制備杏鮑菇抗氧化物的加工方法中，研究用酶解多糖和多肽的酶同時對杏鮑菇進行酶解，從而提高杏鮑菇抗氧化產品品質，為杏鮑菇深加工技術的深入開發提供一定數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏鮑菇（青島市城陽批發市場）；菠蘿蛋白酶（酶活力500 U/mg）、胃蛋白酶（酶活力3 250 U/g）、纖維素酶（酶活力3 U/mg）、胰蛋白酶（酶活力250 U/mg）、木瓜蛋白酶（酶活力800 000 U/g）、中性蛋白酶（酶活力60 000 U/g）、果膠酶（酶活力40 U/mg）、糖化酶（酶活力100 000 U/g）（北京索萊寶科技有限公司）；1, 1-二苯基-2-苦基肼自由基（梯希愛（上海）化成工業發展有限公司）；無水乙醇（AR）、鄰苯三酚（AR）、FeCl2（AR）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 儀器與設備

電子分析天平（奧豪斯國際貿易（上海）有限公司）；二列六孔電熱恒溫水浴鍋（龍口市先科公司）；TGL-16 M高速臺式冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；打漿機（九陽）；UV-2000紫外可見分光光度計（尤尼克（上海）儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 多肽酶的篩選方法

試驗分3組，選取木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、菠蘿蛋白酶在加酶量8 000 U/g及其最適pH及溫度下水浴酶解1.5 h，沸水浴10 min滅酶，離心取上清液，所得上清液即為杏鮑菇多肽酶解液。以DPPH·清除率為指標，篩選酶解杏鮑菇的最佳蛋白酶。

1.3.2 多糖酶的篩選方法

將1.3.1中木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、菠蘿蛋白酶改為纖維素酶、果膠酶和糖化酶，步驟相同。

1.3.3 加酶量的確定方法

在胃蛋白酶和纖維素酶的最適pH（1.96和5.52）和酶解溫度（37和50 ℃）及底物濃度1∶20（g/mL），酶解時間1.5 h，研究加酶量對DPPH·清除率的影響，分為4 000，6 000，8 000，10 000和12 000 U/g[13]5個梯度，確定最適加酶量。

1.4 單因素試驗方法

在最佳酶組合基礎上，在其他試驗條件相同前提下，研究不同底物濃度（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50（g/mL））對杏鮑菇抗氧化物活性的影響；同理在其他試驗條件相同前提下，研究不同pH（1.5，2.5，3.5，4.和5.5）和不同酶解時間（0.1，0.2，0.4，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 h）及不同溫度（4，12，25，37，42，47，52和57 ℃）對杏鮑菇抗氧化物活性的影響，以DPPH·清除率為指標。

1.5 DPPH·清除能力的測定方法

依次加入試劑，充分混勻，室溫黑暗處靜置反應30 min，在517 nm處測定[14]。

DPPH·清除率=[1-（Aa-Ab）/A0]×100% （1）

式中：Aa為樣品吸光度；Ab為樣參吸光度；A0為對照吸光度。

1.6 響應面試驗方法

綜合單因素試驗結果，選取酶解溫度、pH、胃蛋白酶加酶量、纖維素酶加酶量為變量，分別以A、B、C、D表示，DPPH·清除率Y為響應值，以-1、0、1分別代表變量的水平，確定杏鮑菇酶解液抗氧化活性的最佳制備工藝條件，試驗設計的因素水平如表1。

1.6.1 ·OH清除能力的測定方法

在試管中依次加入3.5 mL去離子水，0.5 mL水楊酸-乙醇溶液，0.5 mL樣品，0.5 mL FeCl2溶液，5 mL H2O2，搖勻，在510 nm處測定吸光度[15]。

式中：A1為樣品的吸光度；A2為蒸餾水替代9 mmoL/L的FeCl2的吸光度；A3為去離子水替代樣品溶液的吸光度。

1.6.2 O2-清除能力的測定方法

采用鄰苯三酚自氧化法[16]。以等體積0.01 mol/L HCl代替鄰苯三酚為空白調零，對照組為等體積二次水代替樣品。對照品為VC。

式中：A0為對照組的吸光度；A為樣品組的吸光度。

表1 響應面試驗因素水平編碼

2 結果與分析

2.1 酶的篩選結果

圖1 多肽酶的DPPH清除率結果

圖2 多糖酶的DPPH清除率結果

由圖1和圖2表明，生杏鮑菇加酶酶解后效果更好，杏鮑菇煮熟后進行酶解清除率多數比生杏鮑菇不加酶高，說明煮熟后的杏鮑菇經過酶解也存在抗氧化活性，但抗氧化活性不如生杏鮑菇加酶酶解后效果好。多肽酶抗氧化活性大小為：胃蛋白酶＞胰蛋白酶＞菠蘿蛋白酶＞中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶。而多糖酶抗氧化活性大小依次為：纖維素酶＞果膠酶＞糖化酶。由此可以看出，經胃蛋白酶和纖維素酶酶解后的杏鮑菇酶解液抗氧化活性最好。

2.2 加酶量的確定結果

隨著加酶量增加，加入纖維素酶后的酶解液抗氧化活性越來越強，在10 000 U/g時達到最大值，而胃蛋白酶在6 000 U/g時達到最大值，隨后逐漸降低，但加酶量12 000 U/g時清除率又提高，由于加酶量太多，不符合經濟效益且清除率并沒有超過最大值，因此選擇纖維素酶加酶量為10 000 U/g，選擇胃蛋白酶加酶量為6 000 U/g。

2.3 單因素試驗結果

2.3.1 不同底物濃度對抗氧化活性的影響

由圖3（a）可知，杏鮑菇溶液隨著底物濃度逐漸降低，其DPPH清除率也降低，杏鮑菇酶解液的DPPH清除率為最大值時的底物濃度為1∶10（g/mL）。表明較高的底物濃度對抗氧化活性有很大影響，所以選擇1∶10（g/mL）為最佳底物濃度。

2.3.2 不同pH對抗氧化活性的影響

由圖3（b）可知，pH增加到2.5時，清除率急劇下降，達到最低值，之后隨著pH逐漸增加，清除率也逐漸上升，但沒有超過最高值，綜合考慮最佳pH為3.5。

2.3.3 不同酶解時間對抗氧化活性的影響

由圖3（c）可知，10～40 min杏鮑菇酶解液的DPPH清除率普遍很低，說明時間太短反應不夠充分，清除率隨著酶解時間增加而上升，1.5 h時清除率突然降低，到2 h時清除率開始逐漸升高，直到2.5 h后趨于平緩，選擇最佳酶解時間為2.5 h。

2.3.4 不同溫度對抗氧化活性的影響

由圖3（d）可知，溫度逐漸升高，隨之清除率也逐漸上升，于47 ℃時清除率達到最大值，之后下降，在57 ℃時又有所提高，但沒有超過最大值，考慮經濟效益，因此確定最佳酶解溫度為47 ℃。

2.4 響應面優化試驗

2.4.1 響應面試驗結果及分析

表2為響應面試驗設計與結果。

2.4.2 回歸模型的建立與顯著性分析

通過Design Expert 8.0.5響應面分析軟件對試驗結果進行分析，得到模型所對應的回歸方程為：Y=73.28+2.34A-0.14B+1.72C+0.37D-1.07AB+0.98AC-1.47AD+1.88BC-0.52BD-1.00CD-4.17A2-3.45B2-3.39C2-2.96D2。其中，Y表示DPPH·清除率，A表示酶解時間，B表示pH，C表示胃蛋白酶加酶量，D表示纖維素酶加酶量。

圖3 單因素對抗氧化活性的影響

表2 響應面設計及結果

對響應面試驗結果進行方差分析，所得結果見表3。由表3可以看出，回歸模型呈現極顯著（p＜0.01），模型失擬項為0.111 3＞0.05，無顯著性影響，說明模型擬合程度較好，對試驗結果的分析可采用此回歸方程代替試驗，其校正決定系數為0.933 0，有93.30%的試驗數據的變異性符合這種回歸模型的規律。因此，回歸方程能較好描述響應值與各因素之間的關系，各試驗因子對試驗的影響關系是A＞C＞D＞B，即酶解溫度＞胃蛋白酶加酶量＞纖維素酶＞pH。4個因素中酶解溫度和胃蛋白酶加酶量對試驗結果有極顯著影響（p＜0.01）。交互項中BC顯著性較好，說明pH和胃蛋白酶加酶量之間相互作用對DPPH·清除率影響較大。

表3 響應面方差分析

優化條件的結果見圖4。

圖4（A）表明酶解溫度50 ℃、纖維素酶加酶量10 000 U/g，胃蛋白酶加酶量與酶解pH相互作用對杏鮑菇DPPH·清除率的影響。胃蛋白酶加酶量4 000～6 400 U/g、酶解pH 2.0～3.8時，兩者之間存在協同作用，DPPH·清除率隨著胃蛋白酶加酶量和pH增加而上升；而胃蛋白酶加酶量6 400～8 000 U/g、酶解pH 3.8～ 5.0時，隨著2個因素的增加，清除率逐漸下降。同理圖4（B）中，固定纖維素酶加酶量10 000 U/g及酶解pH 3.5，在胃蛋白酶加酶量4 000～6 400 U/g，酶解溫度42～48 ℃時，DPPH·清除率隨著胃蛋白酶加酶量和酶解溫度增加而上升；而2個因素再增加時，清除率逐漸下降。

胃蛋白酶加酶量和酶解溫度分別為6 000 U/g和50℃時，纖維素酶加酶量與pH交互作用對DPPH·清除率的影響如圖4（C）所示。纖維素酶加酶量保持不變時，隨著pH增加，清除率先增加后降低；同理pH一定時，纖維素酶加酶量變化，清除率的變化也同樣如此。圖4（D）中表明胃蛋白酶加酶量和pH分別為6 000 U/g和3.5時，纖維素酶加酶量維持恒定值時，隨著溫度增加，清除率先增加后趨于平緩；溫度一定時，清除率隨著纖維素酶加酶量的增加而上升隨之趨向于平緩。

圖4（E）表明胃蛋白酶加酶量和纖維素酶加酶量分別為6 000和10 000 U/g，酶解溫度與酶解pH兩者之間的關系對DPPH·清除率的影響。溫度保持不變時，pH逐漸增加，清除率隨之增加到最大值而后降低；pH一定時，清除率隨著溫度增加而增加之后逐漸趨于平緩。圖4（F）中溫度50 ℃、pH 3.5時，DPPH·清除率隨著纖維素酶和胃蛋白酶加酶量的增加而增加，然后趨向平緩。

圖4 兩顯著交互效應對DPPH·清除率的影響

2.4.3 最優化工藝條件

通過Design Expert 8.0.5響應面分析軟件處理數據和進行分析，得出杏鮑菇酶解液抗氧化活性最佳條件為：酶解溫度52 ℃，pH 3.4，胃蛋白酶加酶量6 848 U/g，纖維素酶加酶量9 487 U/g。在此條件下DPPH·清除率達72.2%。

通過3次驗證試驗發現，在此條件下所得杏鮑菇酶解液抗氧化活性依次為71.6%，72.9%和72.6%，平均提取率為72.2%，與模型預測數值較接近；表明試驗的研究工藝具有很好穩定性。

2.4.4 清除·OH和O2-·結果分析·

OH清除能力的測定結果為62.4%，O2-·清除能力測定結果為68.7%，2個指標結果都較高，因此證明模型能很好地預測試驗結果。

3 討論與結論

近年來杏鮑菇產品深加工技術發展越來越迅速，杏鮑菇產品的種類和功能也越來越豐富。研究采用復合酶法制備杏鮑菇抗氧化物，其效果極顯著。復合酶法是2種酶甚至是多種酶共同酶解天然產物，能提高抗氧化產物活性。對杏鮑菇的研究已非常深入，但主要集中在多糖級分的提取[17]，Li等[18]研究杏鮑菇中提取多糖方法的比較；Zhang等[19]研究杏鮑菇細胞中多糖抗氧化性；Ayala-Zavala[20]及Zou等[21]研究抗氧化活性的作用。而制備杏鮑菇抗氧化物過程中復合酶法應用的文獻很少。施瑛等[22]研究復合酶法提取紫菜藻紅蛋白工藝，證實多種酶同時添加比只添加一種酶的效果好。Liu等[23]研究復合酶處理能夠提高可溶性結合物的抗氧化活性。復合酶法這一方法制備杏鮑菇抗氧化物確實能起到良好效果。

研究表明，分別在選取的5種多肽酶和3種多糖酶中，胃蛋白酶和纖維素酶的抗氧化活性效果最好。在單因素試驗的基礎上進行響應面優化，把酶解溫度、pH、胃蛋白酶加酶量及纖維素酶加酶量這4個因素作為影響因子進行優化，結果顯示酶解溫度和胃蛋白酶加酶量對試驗結果有極顯著影響，pH和胃蛋白酶加酶量的相互作用對DPPH·清除率的影響較大，得出優化結果為：酶解溫度52 ℃，pH 3.4，胃蛋白酶加酶量6 848 U/g，纖維素酶加酶量9 487 U/g。在此條件下，DPPH·清除率達72.2%，經過3次試驗驗證表明模型能很好預測試驗結果。由此可知，復合酶法制備杏鮑菇抗氧化物效果好，不僅可使杏鮑菇酶解液酶解后的DPPH清除率大幅度提高，而且反應條件溫和，經濟效益達到最佳，為杏鮑菇深加工產品增添新的產品形式。