RNA、lnc-EGFR對肝細胞癌免疫逃避調節的相關性

魏媛媛 田艷紅 李紅靜 張浩 李木松

免疫機制與肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的發生發展有密切關系，免疫逃避可協助清除入侵機體的病原體對正常細胞的損害[1]。癌細胞生長迅速，受免疫細胞分泌的細胞因子的影響易分化、繁殖，既往臨床資料顯示HCC五年生存率日益降低[2]。最初研究認為，炎性因子、轉化生長因子及腫瘤壞死因子可直接反映HCC患者機體免疫機制[3]。近年來文獻報道，RNA可在多種惡性腫瘤中呈高表達，提示其可能為預測疾病發展和轉歸更敏感指標[4]。最新研究指出，細胞癌化后可引起表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)活化，且T調節細胞(T regulatory cells, Treg)和EGFR可共同表達[5]。本研究探討RNA、lnc-EGFR表達對HCC免疫逃避調節影響及其相關性，為臨床防治HCC提供具有臨床價值的信息。

資料與方法

一、臨床資料

所有HCC組織來自保定市第一中心病醫院病理檔案室，收集時間為2017年1月至2019年1月。研究由醫學倫理會批準，并獲得患者同意。納入標準：①實驗室和CT檢查高度疑似HCC；②最終經病理診斷為HCC；③標本保存完整；④年齡20～65歲；⑤臨床資料完整，各項檢查完善。排除標準：①合并心、肝、腎、肺方面嚴重疾病；②有肝癌手術治療史；③住院資料不完整，各項檢查不完善；④合并自身免疫性、藥物性、細菌性、酒精性、化學毒物性肝病；⑤合并心血管系統及其他病毒感染疾病者。按照納入標準共選擇HCC標本30份與癌旁正常組織30份。

二、方法

將HCC組織與癌旁正常組織分別充分剪碎研磨，加入組織裂解液(上海奧陸生物科技有限公司)及細胞裂解液(上海奧陸生物科技有限公司)充分反應，采用含60對HCC組織和癌旁組織的組織芯片和免疫組化方法對組織細胞進行染色。各組織中RNA、lnc-EGFR表達水平采用RT-PCR法檢測，化學因子及細胞免疫因子均采用蛋白質印跡法檢測。

將HCC細胞株(上海斯信生物科技有限公司)隨機分為兩組，分別為RNA、lnc-EGFR抑制組與空白對照組，其中抑制組細胞給予RNA、lnc-EGFR抑制劑轉染，空白對照組細胞不作任何處理；轉染結束并更換新鮮細胞培養液后，將兩組細胞置于37 ℃、體積分數為0.05的二氧化碳恒溫培養箱中培養48 h；MTT法檢測細胞增殖情況(試劑購自上海恪敏生物科技有限公司)；流式細胞儀(購自德國貝克曼庫爾特，型號FC500)檢測細胞凋亡情況與細胞周期分布情況。

三、RT-PCR

采用Trizol試劑盒(上海名勁生物科技有限公司)提取總RNA，并分析RNA完整性及純度；采用反轉錄試劑盒(焦作路非凡生物科技有限公司)分別反轉錄RNA、lnc-EGFR得cDNA，將其凍存于-20℃備用；ABI StepOnePlus實時熒光定量PCR儀(上海奧陸生物科技有限公司)依次對cDNA進行95℃預變性30 s、95℃變性10 s、61.4℃退火15 s，共循環39次。并重復PCR操作次數增加擴增產物；閾值比較法對結果進行判定。

四、 蛋白質印跡檢測

取肝臟組織剪碎、加RIPA裂解液，置于組織勻漿器中，離心半徑20 cm、10 000 r/min離心5 min，取總蛋白，使用BCA試劑盒測定蛋白質濃度；取總蛋白上樣、電泳變性、切膠、轉至PVDF膜上、TBS-T 25℃封閉1 h，加入兔抗人單克隆抗體(分別為CXCL12-CXCR4、CCL20-CCR6、CX3CLI-CX3CR1，購自北京紐樸生物技術有限公司)于4℃搖床孵育；PBST洗膜，加二抗(1∶2 000)，4℃搖床過夜；PBST洗膜，ECL發光試劑盒顯色、顯影，以GAPDH為內參蛋白，用Image Quant TL軟件分析各條條帶的灰度值，用凝膠成像儀觀察結果。采用GAPDH和β-actin作為內參，根據檢測目的蛋白大小進行選擇，相對分子質量為43×103的蛋白選擇β-actin，相對分子質量為146×103的蛋白選擇GAPDH。

五、觀察指標

HCC、癌旁正常組織中RNA、lnc-EGFR、化學因子、白介素-6(interleukin-6, IL-6)、IL-10、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)表達情況，抑制組和空白對照組細胞增殖、凋亡與細胞周期變化情況。

六、統計學處理

結 果

一、RNA、lnc-EGFR比較

癌旁正常組織中RNA、lnc-EGFR表達水平分別為(0.46±0.12)和(0.62±0.15)，HCC組織為(0.22±0.06)和(0.14±0.05)，差異均有統計學意義(P<0.05)。

二、化學因子比較

HCC與癌旁正常組織中CXCL12-CXCR4、CCL20-CCR6、CX3CLI-CX3CR1水平比較差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

三、細胞免疫因子比較

HCC與癌旁正常組織中IL-6、IL-10、TGF-β、TNF-α比較差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

四、 RNA、lnc-EGFR與化學因子、細胞免疫因子相關性

HCC組織中RNA、lnc-EGFR與CXCL12-CXCR4為負相關關系(P<0.05)，與CCL20-CCR6、CX3CLI-CX3CR1、IL-6、IL-10、TGF-β、TNF-α為正相關關系(P<0.05)。

五、細胞情況比較

兩種組織中細胞相對吸光度、凋亡率、周期占比比較差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。

討 論

發生HCC的機制較復雜，且病情進展缺乏規律性，具有高致殘率和高復發率。有學者指出，肝癌細胞為可溶性免疫抑制因子，可刺激B細胞、樹突狀細胞產生大量免疫因子，其對疾病惡化和預后有較大影響[6]。

表1 HCC與癌旁正常組織中化學因子比較(±s)

表2 HCC與癌旁正常組織中細胞免疫因子比較(±s)

表3 細胞情況比較

C類具有生物活性小分子蛋白質由效應細胞分泌，參與癌細胞增殖與凋亡。C類蛋白可控制諸多信號轉導通路，在細胞遷移、周期、基因轉錄及其腫瘤增殖及凋亡中均有一定作用，已有研究證實其可作為預測HCC免疫逃避作用敏感性指標[7]。Jiang等[8]發現，細胞免疫因子可促進新血管生成和免疫機制來抑制癌細胞異常分化發育。Attia等[9]報道，IL-6、IL-10、TGF-β、TNF-α表達水平對HCC免疫逃避作用的判斷具有較高特異性。綜上提示各細胞因子與HCC免疫逃避作用具有一定相關性，但劉璐璐等[10]報道，在HCC發展過程中可動態監控RNA水平來判斷預后，聯合特異性內皮因子lnc-EGFR對癌細胞發展具有更高敏感性和特異性。RNA為多基因生長負調控因子，與炎癥反應、細胞增殖、免疫調節、創傷修復等多種病理生理過程密切相關。趙冀等[11]研究證明，RNA可作為原癌基因或抑癌基因，在惡性腫瘤的發生、發展及轉移、侵襲過程中發揮重要作用。張金蓮等[12]報道，RNA在肝癌細胞表面呈高表達，且其可促進肝癌細胞的遷移與侵襲。Sun等[13]研究發現，lnc-EGFR在人舌癌中呈高表達，且高水平的lnc-EGFR提示患者預后不良。另有學者指出，Lnc-EGFR高表達組織中，FOXP3表達和Treg細胞在T細胞中占比也上調，提示其對免疫逃避作用具有高敏感性[14]。本研究結果顯示，RNA、lnc-EGFR在癌組織中水平更高，與上述文獻結論較為一致，證實其與HCC發生有一定關系。探究其作用機制發現，Treg信號通路在細胞增殖、器官形成、組織再生過程中具有重要作用，而RNA、lnc-EGFR可上調其表達水平，提示其與HCC形成、發展有密切聯系。化學因子與細胞免疫因子是Treg信號通路負調控因子，蔡宗發等[15]研究證實，化學因子和免疫細胞因子在HCC組織中表達缺失可導致肝癌細胞生長加速。

本研究中，HCC組織中CCL20-CCR6、CX3CLI-CX3CR1及細胞免疫因子IL-6、IL-10、TGF-β、TNF-α表達水平高于癌旁正常組織，提示RNA、lnc-EGFR對化學因子、細胞免疫因子具有上調作用來逃避免疫機制。本研究中抑制組細胞吸光度和凋亡率優于空白對照組，提示RNA、lnc-EGFR對細胞增殖有促進作用，減緩其凋亡。G0/G1期在細胞周期中表示細胞增殖較活躍，本研究中抑制組G0/G1期細胞率大于對照組，但G2/M期細胞率小于對照組，提示RNA、lnc-EGFR可增加HCC細胞增殖活性。

綜上所述，RNA、lnc-EGFR與HCC免疫逃避機制呈顯著相關性，可促進肝癌細胞株早期凋亡。