不同免疫狀態慢性HBV感染患者的T淋巴細胞及NKG2D表達差異研究

王賢 林濤發 詹志瑜 王少揚

NKG2D是NK細胞、NKT細胞及部分活化CD8+T淋巴細胞表面的一種復合體型強效活化受體，在乙肝免疫發病機制中起重要作用[1-2]。為了更深入了解NKG2D介導NK細胞活化在HBV感染免疫病理損傷中的作用，以及T淋巴細胞亞群的表達特征。本研究對不同免疫狀態慢性HBV感染者的血清NKG2D水平進行了測定和對照分析，現報道如下。

對象與方法

一、研究對象

研究對象為聯勤保障部隊第九〇〇醫院從2017年1月至2018年12月接診的80例慢性HBV感染患者及30名健康體檢者。慢性HBV感染患者中男性45例，女性35例，年齡20～62歲，平均年齡(36. 1±4.6)歲；健康體檢者男性16名，女性14名，年齡18～64歲，平均年齡(35.6±5.0)歲。慢性HBV感染者根據免疫狀態的不同分為免疫耐受組(28例)、免疫清除組(30例)、低(非)復制組(22例)，健康體檢者納入對照組。入組對象均對本次研究知情了解，自愿參與研究并簽署了知情同意書。本研究通過了本院醫學倫理委員會批準。

納入標準：①年齡18～65歲；②慢性HBV感染者符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[3]的診斷及分型標準。排除標準：①感染其他肝炎病毒者(如HAV、HCV、HEV等)；②合并脂肪性、免疫性、代謝性、藥物性肝病者；③處于哺乳期或妊娠期者；④病毒感染史不明確者；⑤已發展為肝硬化或肝癌者；⑥合并嚴重心腦腎肺功能障礙者。

二、方法

1.肝功能檢測：采集患者的空腹靜脈血，使用Olympus AU640全自動生化儀進行肝功能檢測。肝功能指標包括ALT、總膽紅素(TBil)、白蛋白。

2.HBV血清標記物檢測：儀器選用ANYTEST 2000時間分辨儀(上海新波生物技術有限公司生產)，采用時間分辨熒光分析法測定HBV血清標志物，包括HBeAg、HBsAg、抗-HBc、抗-HBe。

3.HBV DNA定量檢測：儀器選用OpticonMonitor實時熒光定量PCR儀(美國MJResearch公司生產)，檢測方法采用實時熒光探針定量-聚合酶鏈反應。

4.外周血淋巴細胞亞群檢測：常規采集靜脈外周血，儀器選用EPICS-XL流式細胞儀(美國BeckmanCoulter公司生產)，試劑為四色淋巴細胞亞群試劑，檢測方法為四色熒光標記流式細胞術。檢測內容包括CD3+、CD4+、CD8+、NK細胞及NKG2D+/NK細胞百分比。在5支流式細胞檢測計數管中分別加入20 μL的CD3+、CD4+、CD8+、NK細胞或NKG2D+/NK熒光標記抗體，然后加入混合均勻的抗凝全血50 μL，渦旋混勻15 s，室溫避光孵育15 min，然后加入450 μL溶血素，充分振蕩混合均勻，室溫避光孵育15 min，然后使用流式細胞儀進行檢測。NKG2D+/NK細胞百分比：測定NK細胞占總淋巴細胞百分率，再以NPC-NKG2D標記抗體(美國BioLegend公司生產)計數NK細胞群中NKG2D+NK細胞百分率及平均熒光強度。利用EXPO2分析軟件進行補償調節，以獲取細胞頻數及圖像。

5.血清TNF-α、γ干擾素檢測：采用酶聯免疫吸附法測定外周血中TNF-α、γ干擾素水平，試劑盒均由美國R&D公司提供，嚴格按照試劑盒操作說明書進行檢測。檢測步驟：對血液標本進行高速離心后，保留血清待檢。準備試劑、樣品及標準品，設置對照孔、標準孔、待測樣品孔。在標準品酶標抗體微孔板上加入50 μL標準品，待測樣品酶標抗體微孔板上加入40 μL待測樣品稀釋液，再加入10 μL待測樣品液。所有微孔板使用封板模進行處理，37℃孵育30 min。拆除微孔板表面的封板膜，并移除表面液體，風干。在微孔板中加入洗滌液，30 s后移除表面洗滌液，重復5次，風干。在標準孔及待測樣品孔中各加入50 μL酶標試劑液，37℃孵育30 min，洗滌，然后在各微孔板中先后加入50 μL的A顯色劑和B顯色劑，振蕩均勻，避光靜置顯色10 min。向各微孔板加入50 μL終止液以終止反應，最后使用450 nm波長的酶標儀對微孔板的吸光度進行測量。繪制吸光度標準曲線，計算出相應濃度，并乘以相應稀釋倍數，最終獲得實際樣品濃度。

三、統計學方法

結 果

一、T細胞、NK細胞、NKG2D+/NK細胞百分比

4組研究對象的CD3+T淋巴細胞百分比接近，差異無統計學意義(P>0.05)。CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、CD4+/CD8+、NK細胞、NKG2D+/NK細胞百分比比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；免疫清除組的CD4+T淋巴細胞、CD4+/CD8+、NK細胞百分比均顯著低于另外3組，CD8+T淋巴細胞、NKG2D+/NK細胞百分比均顯著高于另外3組(P<0.05)。與對照組相比，免疫耐受組、免疫清除組、低(非)復制組的CD4+T淋巴細胞、CD4+/CD8+水平明顯更低，CD8+T淋巴細胞水平明顯更高(P<0.05)。免疫耐受組和低(非)復制組的NKG2D+/NK細胞百分比均顯著低于對照組，免疫清除組的NKG2D+/NK細胞百分比顯著高于對照組(P<0.05)。免疫耐受組、低(非)復制組、對照組的NK細胞水平比較，差異無統計學意義(均P>0.05)。見表1。

二、血清TNF-α、γ干擾素水平

4組研究對象的血清TNF-α、γ干擾素水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；免疫清除組的TNF-α、γ干擾素水平均顯著高于免疫耐受組、低(非)復制組及對照組(P<0.05)。免疫耐受組、低(非)復制組及對照組的TNF-α、γ干擾素水平比較，差異均無統計意義(P>0.05)。見表2。

表2 4組研究對象血清TNF-α、γ干擾素水平比較(ng/L，±s)

注：*與對照組比較，#與免疫清除組比較，P<0.05

討 論

正常狀態下，CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞相互制約、相互協作，并始終維持在平衡狀態。臨床經常通過CD4+/CD8+來判定機體的免疫平衡狀態，其比值是機體細胞免疫功能狀態的直接反映[4-5]。本研究結果顯示，與對照組相比，免疫耐受組、免疫清除組、低(非)復制組的CD4+T淋巴細胞、CD4+/CD8+水平明顯更低，CD8+T淋巴細胞水平明顯更高，說明HBV感染對機體的細胞免疫功能造成了明顯影響。免疫清除組的CD4+T淋巴細胞、CD4+/CD8+百分比均顯著低于另外3組，CD8+T淋巴細胞百分比均顯著高于另外3組；與文獻報道結論相符[6-7]。這表明慢性HBV感染會對CD4+T淋巴細胞造成破壞，降低CD4+T淋巴細胞水平，造成體內特異性抗體生成不足。同時，HBV感染還會造成CD8+T淋巴細胞寡克隆增加，大量的CD8+T淋巴細胞會對CD4+T淋巴細胞產生抑制作用，進而進一步降低CD4+T淋巴細胞的病毒清除能力[8]。

本研究結果顯示，免疫清除組的血清NK細胞百分比明顯比免疫耐受組和低(非)復制組更低。這提示NK細胞可能參與了慢性HBV感染免疫耐受打破、HBV復制抑制與抗病毒免疫過程。免疫清除階段外周血NK細胞的減少，可能是因為該時期的肝細胞損傷明顯，肝外大量的NK細胞被趨化至肝臟發揮免疫調控，或者介導肝細胞免疫損傷作用，所以外周血中的NK細胞數會明顯減少[9]。王亞東等報道[10]，阻斷NKG2D表達能夠使肝組織的炎性損傷程度顯著減輕，這表明NKG2D可能是NK細胞發揮靶向殺傷效應的一個重要途徑，G2D表達上調可激活NK細胞，從而在HBV致肝損傷中發揮獨特作用。本研究結果顯示，免疫清除組的NKG2D+/NK細胞百分比顯著高于免疫耐受組和低(非)復制組。這表明NKG2D的過度表達與活化，能夠促進NK細胞發揮靶細胞毒性效應，誘發肝組織的病理性損傷。結果還顯示，免疫耐受組和低(非)復制組的NKG2D+/NK細胞百分比均顯著低于對照組。這可能是因為處于免疫耐受期及非活動期的HBV攜帶者，受自身調控機制及病毒的影響，NK細胞活化性受體得到了有效抑制，使機體能夠維持對HBV感染后的免疫耐受或免疫不全狀態，所以這兩個免疫時期HBV感染患者的NKG2D+/NK細胞百分比更低，甚至可能比健康人群更低[11-13]。本研究結果還顯示，免疫清除組伴隨著HBV DNA和NKG2D+/NK細胞百分比的降低，TNF-α、γ干擾素水平明顯升高。提示NKG2D表達會對NK細胞合成、分泌TNF-α、γ干擾素等效應分子產生重要作用。血清TNF-α、γ干擾素水平的升高提示肝臟炎癥損傷明顯，相比免疫耐受期和非活動期HBV感染者，處于免疫清除期的HBV感染者肝臟損傷更為嚴重，所以其血清TNF-α、γ干擾素水平明顯更高[14-15]。

表1 4組研究 對象的T淋巴細胞、NK細胞、NKG2D+ /NK細胞百分比(%，±s)

注：*與對照組比較；#與免疫清除組比較，P<0.05

綜上所述，慢性HBV感染患者在不同免疫狀態下，外周血T淋巴細胞、NK細胞及NKG2D細胞表達有明顯差異，降低NKG2D能夠強化免疫以促進病毒排除，同時還能夠還能抑制NK細胞介導的免疫炎性損傷，減輕肝功能損傷。可通過測定HBV感染者外周血T淋巴細胞、NKG2D細胞水平來評估患者的免疫狀態，指導臨床治療。