大氣CO2濃度及溫度升高對高山灌木鬼箭錦雞兒(Caragana jubata)生長及抗氧化系統的影響

康紅梅,李花花,徐當會,秦 鵬,劉美玲

1 甘肅省科學院生物研究所, 蘭州 730000 2 蘭州大學生命科學學院,草地農業生態系統國家重點實驗室, 蘭州 730000 3 中國科學院西北生態環境資源研究院,沙坡頭沙漠研究試驗站, 蘭州 730000

由于化石燃料的大量應用和森林面積的不斷減少,大氣中作為溫室氣體之一的CO2逐年增加,已從工業革命前的280 μmol/mol上升到現在的大約365 μmol/mol,預計到2100年將達到700 μmol/mol,由此導致的全球平均氣溫將升高2.0—4.5℃,極端氣候的頻率將增加[1]。CO2濃度和溫度是影響植物生長和發育的兩個重要生態因子,兩者在全球變化中的相互作用對木本植物生長和發育具有顯著影響[2]。

CO2濃度升高可提高植物的光合作用,增大氣孔阻力,減少蒸騰作用,抑制植物的呼吸作用,從而促進植物的生長。但CO2濃度增加對植物的影響是復雜的,許多機制尚未了解[3]。對于多數陸生植物來說,CO2濃度增加可以促進光合作用[4],但在干旱條件下CO2濃度倍增不能增加植物的生長[5- 8]。植物生長還取決于植物的種類、年齡、觀察的時期、生長的條件[9]以及土壤的營養狀況[8]等條件。不斷增加的大氣CO2濃度促進根的生物量增加要大于對地上部分生物量的影響[10]。

環境溫度升高與CO2濃度富集相似,可以提高植物光合速率和生產力[11-12],尤其在寒冷的季節和水分充足條件下[13]。未來氣候變化(尤其是溫度升高),從短期看主要是影響光合作用,但這些影響又因物種不同而不同[14-16]。植物的光合作用和生長量在不同降水量和溫度條件下對CO2濃度倍增的響應是不同的,陸地生態系統對環境變化的響應必須考慮物種差異和多重因素[17]。闡明CO2濃度和溫度升高的相互影響對于預測生態系統功能和結構對環境變化的響應有重要意義[3]。

全球氣候變化對植物的抗氧化系統也會產生影響[18]。CO2具有保護作用,可以減輕活性氧(ROS)的產生并增加其抗氧化的能力,但CO2對抗氧化系統影響的分子機制還遠未了解[19]。植物在無脅迫的情況下CO2濃度升高,植物的抗氧化的水平發生變化,暗示著未來氣候變化會影響細胞的氧化還原狀況[20-21]。抗氧化酶和抗氧化物不僅能夠控制植株的氧化傷害,還可作為氧化還原信號,是研究全球環境變化下脅迫對植株產生影響的首選對象[14]。

鬼箭錦雞兒(Caraganajubata)是西北高山區典型灌木,主要分布在青藏高原和喜馬拉雅地區的高山、中亞天山及西伯利亞山地的高山草甸草原[22]。在甘肅祁連山、馬銜山和甘南的瑪曲、卓尼也有分布,是高山草甸帶的重要組成物種。研究環境條件變化對鬼箭錦雞兒生長和抗氧化系統的影響,對于預測大氣環境變化對高寒區植物的影響是極其重要和必要的。本研究以鬼箭錦雞兒為實驗對象,探討環境變化對其生長和抗氧化系統的影響,驗證以下假設：

(1)CO2濃度升高和溫度升高有利于鬼箭錦雞兒幼苗的生長。

(2)環境條件變化將影響植物的抗氧化系統,CO2濃度升高對其具有保護作用。

1 材料與方法

試驗采用日本NK培養箱(NC- 241/411HC, Nippon Medical & Chemical Instruments CO., LTD)控制溫度、濕度及CO2濃度。鬼箭錦雞兒種子采自甘肅馬銜山。溫室進行發芽及培養(20—22℃),出苗后選取長勢一致的幼苗移栽于育種缽(d=9.5 cm),基質為混合土(營養土∶珍珠巖∶蛭石=3∶1∶1),培養1個月后進行分組實驗。

培養條件：光照600 μmol m-2s-1(12 h/d),相對濕度50%/70%(day/night)。兩種CO2濃度(C1: 400 μmol/mol, C2: 800 μmol/mol),兩種環境溫度(T1: 20℃/10℃,T2: 23℃/13℃ day/night)。每4天澆一次水,每缽70—80 mL。共4個處理(C1T1,C2T1,C1T2,C2T2),每個處理分為2組,每組8—10株,培養7周后,1組收獲,另1組進行水分脅迫實驗。在收獲前的2天,用保鮮膜將育種缽包裹完全后稱重,24 h后再次稱重,以計算蒸騰速率(E)。對培養前和培養后的幼苗根、莖、葉分別烘干后稱重,烘干前采用掃描法測量葉面積(ImageJ軟件)。通過停止澆水來進行水分脅迫,分別在1 d、8 d、15 d和20 d采集葉片液氮保存用于抗氧化酶及抗氧化劑含量測定。

參數計算及統計方法：凈光合速率(NAR,Net assimilation rate)及相對生長速率(RGR,Relative growth rate)根據以下公式計算：

(1)

(2)

式中,w1和s1是實驗開始時(t1)植株的干物質量和總葉面積,w2和s2是實驗結束時(t2)收獲的總干物質量和總葉面積[23-24]。

從原始數據可以計算出其他參數：葉生物量比(LMR, Leaf mass ratio; 葉生物量/總生物量)、葉面積比(LAR, Leaf area ratio; 葉面積/總生物量)、比葉面積(SLA, Specific leaf area; 葉面積/葉生物量)、地下與地上生物量比(BAMR, Below ground to above ground biomass ratio; 地下生物量/地上生物量)、根生物量比(RMR, Root mass ratio; 根生物量/總生物量)、根莖比(RSR, Root to stem ratio; 根生物量/莖生物量)、水分利用效率(WUE, Water use efficiency; 生物量的增加/蒸騰量)。

粗酶提取及抗氧化酶活性和抗氧化劑含量測定：粗酶提取采用預冷的磷酸緩沖液[25],4℃保存,用于酶活性測試。采用分光光度法測定過氧化物酶(POD, Peroxidase)[26]、過氧化氫酶(CAT, Catalase)[27]、抗壞血酸過氧化物酶(APX, Ascorbate peroxidase)[28]、超氧化歧化酶(SOD, Superoxide dismutase)[29]、谷胱甘肽還原酶(GR, Reduced glutathione)[25]、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR, Monodehydroasorbate reductase)[30]活性。可溶性蛋白含量測定采用G-250染色法。

丙二醛(MDA, Malondialdehyde)、H2O2及抗氧化劑的測定。取0.3 g冷凍的樣品,加5 mL 5% 三氯乙酸冰浴研磨,高速冷凍離心后取上清液備用。采用分光光度法測定MDA,H2O2,還原型谷胱甘肽(GSH, Reduced glutathion),和抗壞血酸(ASA, Ascorbic acid)的含量[31]。

采用SPSS 15.0進行數據分析,用雙因素方差分析(two-way ANOVA)法,分析CO2濃度(C)和環境溫度(T)及其交互作用對鬼箭錦雞兒生長的影響。用Origin 6.1軟件做圖。

2 結果與分析

2.1 CO2濃度增加(eCO2)和溫度增加(eT)對鬼箭錦雞兒幼苗生長的影響

CO2濃度和溫度增加對鬼箭錦雞兒幼苗生長有顯著影響,但對株高和E影響不顯著(表1)。CO2濃度對SLA和WUE的影響要高于溫度對其的影響,而LMR,LAR,BAMR,RMR,RSR對溫度更加敏感。CO2濃度和溫度對總生物量、根長和LAR有交互影響。溫度對植株生長的影響要大于CO2濃度對其的影響。

表1 鬼箭錦雞兒幼苗對不同CO2濃度和溫度響應的雙因素方差分析結果(F)

顯著水平：***,P<0.001；**,P<0.01；*,P<0.05；ns代表差異不顯著,dF是自由度;LMR：葉生物量比Leaf mass ratio；LAR：葉面積Leaf area ratio；SLA：比葉面積Specific leaf area；BAMR：地下與地上生物量比Below ground to above ground biomass ratio；RMR：根生物量比Root mass ratio；WUE：水分利用效率Water use efficiency；E：蒸騰速率Evaporation

CO2濃度及溫度增加對植株幼苗生長的影響如圖1所示。溫度增加對正常CO2濃度下植株總生物量和根長有抑制作用,eCO2可以促進生長,減輕抑制。eT使幼苗總生物量下降了53.1%(C1),根系長度降低30.1%(C1)；eCO2對總生物量和根長有促進作用,C2T2條件下總生物量和根長與C1T1相同。eCO2對常溫下株高有促進作用。

圖1 鬼箭錦雞兒幼苗在不同CO2濃度(C)和溫度(T)下生長49d后的總生物量、株高及根長Fig.1 Biomass, seeding height and root length of C. jubata seedlings under CO2 concentration and alternating temperatures in growth chamber 數值為平均值±標準誤；C1: 400 μmol/mol, C2: 800 μmol/mol; T1: 20℃/10℃, T2: 23℃/13℃

環境條件變化對幼苗NAR和RGR的影響如圖2所示。eT使得幼苗的NAR下降了41.8%(C2)—66.9%(C1),RGR降低了32.5%(C2)和59.7%(C1)；eCO2使得幼苗的NAR增加了29.5%(T1)—134.8%(T2)。C2T2比C1T1仍然低16.9%(NAR)和27.7%(RGR),說明eCO2可部分緩解eT對NAR和RGR的抑制。

圖2 鬼箭錦雞兒幼苗在不同CO2濃度(C)和溫度(T)下生長49 d的凈光合速率和相對生長速率Fig.2 Net assimilation rate and Relative growth rate of C. jubata under CO2 concentration and alternating temperatures in growth chamber

環境條件變化對植株幼苗生長參數的影響如圖3所示。eCO2和eT表現出相反的效應。eCO2不同程度的降低了LMR和LAR,但BAMR、RMR和RSR有不同程度增加。LMR降低了26.6%(T2),LAR降低了33.0%(T1)和37.8%(T2)；BAMR增加28.8%(T1)和34.0%(T2),RMR增加了14.3%(T1)；RSR增加了21.0%(T1)。相反,eT不同程度的增加了LMR和LAR,但降低了BAMR、RMR和RSR。LMR增加89.8%(C2)和94.0%(C1)；LAR增加108.1%(C2)和123.8%(C1)；BAMR降低了59.8%(C2)和62.8%(C1)；RMR降低了39.0%(C2)和47.4%(C1)；RSR降低了46.3%(C1)和50.1%(C2)。所以,溫度增加有利于葉的生長,而CO2濃度倍增促進根的發育。

圖3 鬼箭錦雞兒幼苗在不同CO2濃度(C)和溫度(T)條件下生長49 d后的生長參數Fig.3 Parameters of C. jubata seedlings under CO2 concentration and alternating temperatures in growth chamber

eCO2和eT對C.jubata幼苗E和WUE的影響如圖4所示。CO2濃度增加可以降低常溫下的蒸騰,增加水分利用效率。eCO2使得E降低了51.6%(T1),WUE增加了87.9%(T2)和178.8%(T1)。eT使得E降低33.9%(C1)或增加27.5%(C2),WUE降低了41.3%(C1)和60.2%(C2)。

圖4 鬼箭錦雞兒幼苗在不同CO2濃度(C)和溫度(T)條件下的蒸騰速率和水分利用效率Fig.4 Evaporation and Water use efficiency of C. jubata under CO2 concentration and alternating temperatures in growth chamber

2.2 eCO2和eT對鬼箭錦雞兒抗氧化系統的影響

停止澆水后,土壤含水量(SWC, Soil water content)、葉片MDA及H2O2含量的變化如圖 5所示。SWC下降了62.5%—78.0%,達到極度干旱程度。MDA在4種處理中均有不同程度的升高。T2條件下MDA升高了109.1%(C1)和129.5%(C2)；而T1條件下只升高了17.7%(C1)和42.0%(C2)。同樣,T2條件下H2O2增加了82.6%(C1)和186.7(C2)；而T1條件下只升高了39.6%(C1)和16.9%(C2)。eT 加劇了MDA和H2O2的增加,eCO2只減緩了T1條件下H2O2的增加。

圖5 停止澆水后不同CO2濃度(C)和溫度(T)條件下土壤含水量、葉片丙二醛和H2O2含量的變化Fig.5 Changes of soil water content, malondialdehyde and H2O2 contents in leaves of C. jubata seedlings grown under CO2 concentration and alternating temperatures subjected to drought stress

停止澆水后,各種抗氧化酶活性的變化情況如圖6所示。隨著土壤水分含量的降低,SOD酶表現出活性下降的趨勢,C1T1條件下SOD酶活性下降最多,達40.5%(20 d)。在控水期間,C2T1的SOD酶活性水平保持最高,C2T2的SOD水平持續最低。eCO2對常溫下的SOD酶活性有一定的促進作用。隨干旱程度的增加,CAT酶在eT和eCO2條件下活性下降了36.9%(C1T2)—71.7%(C2T2),但在C1T1條件下升高。溫度增加3℃,POD酶及APX酶整體活性均明顯降低。GR酶在不同溫度下表現出不同的變化趨勢,T1條件下GR升高了57.2%(C2)—160.1%(C1)；T2條件下為先升再降,15 d時GR升高了24.6%(C2)—86.0%(C1),隨后下降,eT表現出對GR的抑制作用。eCO2使得MDHAR活性表現出不同的變化趨勢,C1條件下升高了44.5%(T1)和53.9%(T2)而C2條件下先升再降。因此,溫度升高對幼苗葉片抗氧化酶活性產生抑制作用,但eCO2未表現出明顯的保護作用。

圖6 停止澆水后不同CO2濃度(C)和溫度(T)條件下鬼箭錦雞兒葉片抗氧化酶活性的變化Fig.6 Changes of antioxidant enzymes′ activities in leaves of C. jubata grown under CO2 concentration and alternating temperatures subjected to drought stress

控水條件下,抗氧化劑含量的變化如圖7所示。GSH在控水15d后增加了17.6%(C1T1)—151.2%(C1T2),但隨后下降。AsA含量在C2T1條件下下降了41.0%(15d),在其他3種情況下升高了73.6%(C1T1)—227.8%(C1T2)。環境溫度增加3℃,葉片抗氧化劑GSH平均水平下降15.4%(C1)—31.1%(C2),ASA平均水平下降了27.2%(C2)—47.5%(C1)。CO2濃度倍增使兩種溫度條件下的ASA水平增加,但只對常溫條件下GSH水平有促進作用。因此,溫度增加對抗氧化劑有抑制作用,eCO2有一定的保護作用。

圖7 停止澆水后不同CO2濃度(C)和溫度(T)條件下鬼箭錦雞兒葉片抗氧化劑含量的變化Fig.7 Changes of antioxidant content in leaves of C. jubata grown under CO2 concentration and alternating temperatures subjected to drought stress

3 討論

環境溫度和CO2濃度升高將對植物生長產生較大影響。溫度升高和CO2濃度升高可協同促進植物生長和光合能力[32],高水平CO2對高溫下的光合器官有保護作用[33]。溫度增加促進正常水分條件下小葉錦雞兒(C.microphylla)生長[17],增加中間錦雞兒(C.intermedia)及蒙古巖黃耆(Hedysarummongolicum)幼苗生物量和根莖比[34],但CO2濃度倍增沒有增加紫花苜蓿(MedicagasativaL.)的生物量,也并未對黑麥草(LoliumperenneL.)表現出保護作用[19]。Way和Oren[12]從63個研究中得出結論,生長在高海拔或高緯度的樹種可能是受溫度限制的,所以環境溫度升高將對其生物量、株高等產生有益的影響,至少在最初對溫度升高應表現出正響應。因此我們預測溫度升高和CO2濃度倍增有利于高寒區灌木的生長。然而,我們的實驗結果顯示,溫度升高3℃顯著降低了幼苗的總生物量、凈光合速率和相對生長速率,雖然eCO2有一定的促進生長作用,但eT對幼苗生長的影響要更大些(表1)。溫度升高和CO2濃度倍增并沒有協同促進幼苗的生長和光合能力,可能因為幼苗的生長并非溫度限制,也可能是由于物種的特性。預示著溫度增加將對高寒區灌木幼苗生長產生不利影響,eCO2可緩解增溫的影響,兩者無協同促進作用。

溫度和CO2濃度升高可能對植物的生長和生理過程有對抗性的作用[35]。空氣中CO2濃度增加一般會促進樹木地上植株的生長和發育[36],增加植物的根系面積,促進根系分泌物的釋放,改變根際微生物的多樣性,也可能會增加植物的呼吸作用和光合速率[37]。過高的溫度將會抑制植物的生長、光合和水分利用效率。我們的實驗結果顯示,溫度升高和CO2富集對幼苗生長有對抗性作用,兩者無交互作用(表1)。溫度增加使得LMR、LAR增加,BAMR、RMR、RSR下降,說明溫度增加有利于葉生物量及葉面積增加,葉片變薄；相反CO2濃度增加使LMR、LAR下降,BAMR、RMR、RSR升高,說明CO2濃度倍增促進根系的生長,增加葉片厚度。因此,CO2濃度升高可以促進幼苗根系發育,進而增加對土壤養分和水分的利用；相反,溫度增加促進更多碳同化物分配至地上部分。

SOD、POD、“抗壞血酸-谷胱甘肽循環” (ASA-GSH cycle)是旱生錦雞兒屬植物抵御干旱,保護細胞正常的生理活動,適應干旱環境的物質基礎。CAT在抵御干旱,保護細胞正常生理活動中作用有限[38]。高的CO2濃度可以減輕由干旱和高溫對植株細胞膜產生的氧化傷害[17]。植物也可以通過吸收更多的碳來應對未來升溫的影響[39]。鬼箭錦雞兒長期生活在高寒地區,其抗氧化系統對干旱脅迫表現出不同的響應。SOD酶活性隨SWC的下降而表現出下降的趨勢,CO2增施可以使SOD酶活性增加(T1)；但溫度增加后,CO2增施不能提高SOD活性。說明升溫條件下,eCO2不能增強其抗性,推測可能是高寒植物的SOD酶對溫度敏感。同樣,環境溫度增加使得POD、APX、GR酶活性降低,ASA和GSH含量降低,也說明溫度增加對抗氧化系統的影響較大。雖然eCO2可以增加抗氧化劑含量,但eCO2只減緩了T1條件下H2O2的增加,說明溫度增加加劇了干旱脅迫對植株的傷害,eCO2只能部分的緩解這種不利影響。已有研究表明高濃度CO2可促進ASA合成或降低消耗[40],我們的研究中也發現CO2濃度倍增使GSH和ASA整體水平提高,暗示著環境變化對抗氧化劑水平的影響。研究推測高寒區灌木抗氧化系統對溫度敏感,eCO2可能會促進抗氧化劑生成以減弱ROS對細胞膜的損害。

研究預測,未來氣候變化將會對高寒區灌木生長及生理產生重大影響。溫度增加可抑制植物的生長和光合能力,抑制抗氧化酶活性和抗氧化劑含量。CO2濃度增加可緩解增溫的影響,促進根的發育。增溫對高寒區植物的影響要大于CO2濃度增加對植物的影響。

結論：(1)溫度升高和CO2濃度升高沒有協同促進鬼箭錦雞兒幼苗的生長和光合能力。溫度升高將會對鬼箭錦雞兒幼苗生長產生不利影響,CO2濃度升高促進地下部分的生長。(2)高寒植物的抗氧化系統對溫度敏感,CO2濃度升高可能通過抗氧化劑的增加來部分緩解不利影響(3)CO2濃度升高可緩解增溫對幼苗生長和抗氧化系統的影響。

致謝：種子采集得到甘肅省科學院生物研究所麻和平、張文奇老師的幫助,試驗過程得到蘭州大學張仁懿老師的幫助,特此致謝。