1例豬繁殖與呼吸綜合征診斷及基因序列分析

童洪生

福建省建寧縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，福建建寧354500

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是一種由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的傳染病。PRRSV 屬于動(dòng)脈炎病毒科成員，是一種有囊膜、單股正鏈RNA病毒，豬被PRRSV 感染后耳部出現(xiàn)發(fā)紫發(fā)紺等癥狀，故被廣泛稱作藍(lán)耳病（blue ear disease）[1]。母豬感染PRRSV 后出現(xiàn)免疫抑制以及持續(xù)感染，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱與食欲降低、反復(fù)不孕、流產(chǎn)等，哺乳仔豬或保育豬易繼發(fā)如豬鏈球菌病、附紅細(xì)胞體、豬喘氣病、豬副嗜血桿菌病、豬肺疫、豬傳染性胸膜肺炎等疾病，給生豬養(yǎng)殖帶來了很大的風(fēng)險(xiǎn)挑戰(zhàn)。為盡快解決疑似PRRS 病例診斷技術(shù)水平，本研究著重開展了血清學(xué)和分子生物學(xué)診斷與基因序列分析，以期在臨床上對(duì)PRRS 的診斷、預(yù)防和控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）發(fā)病背景。福建省三明市某規(guī)模化的自繁自養(yǎng)場(chǎng)存欄母豬800 頭，哺乳仔豬21 日齡斷奶。2019年5 月，出現(xiàn)母豬流產(chǎn)、產(chǎn)床弱仔比例增多等現(xiàn)象，根據(jù)臨床癥狀懷疑是PRRS。藍(lán)耳免疫程序：母豬使用豬繁殖與呼吸道綜合征疫苗（天津株）1 頭份/次，1 年免疫4 次；小豬在14 日齡肌注豬繁殖與呼吸道綜合征疫苗（天津株）1 頭份/次。

2）樣品。血清以及胎衣、扁桃體、肺等組織采集自上述規(guī)模場(chǎng)豬只。

3）儀器。Infinite F50 酶標(biāo)儀，TECAN；MA-Smart實(shí)時(shí)熒光定量PCR，雅睿生物；TOM-XB100 自動(dòng)洗板機(jī)，上海托莫斯；離心機(jī)，美國BECKMAN；全自動(dòng)核酸提取儀，洛陽愛森生物。

1.2 方 法

1）PRRS 抗體檢測(cè)。采樣和檢測(cè)方案：抽取健康母豬、有淚斑或出血點(diǎn)的母豬、近期流產(chǎn)的母豬各7頭，產(chǎn)床上正常的仔豬、產(chǎn)床上病弱豬、斷奶7 d 后弱豬、斷奶7 d 后正常豬、斷奶30 d 弱豬、斷奶60 d弱豬各5 頭，通過前腔靜脈采血收集血清，檢測(cè)PRRS 抗體。采用IDEXX 豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)PRRS 抗體，具體步驟按豬繁殖與呼吸綜合征病毒ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒使用說明書操作。結(jié)果判定：S/P＜0.4 為陰性，S/P≥0.4 為陽性。

2）PRRS 熒光定量PCR 檢測(cè)。用病毒DNA/RNA 提取試劑盒按照使用說明書提取4 頭流產(chǎn)胎兒的扁桃體和肺以及健康母豬、有淚斑或出血點(diǎn)的母豬、近期流產(chǎn)的母豬、產(chǎn)床正常的仔豬、產(chǎn)床上病弱豬、斷奶7 d 后弱豬、斷奶7 d 后正常豬、斷奶30 d 弱豬、斷奶60 d 弱豬血清中的繁殖與呼吸綜合征病毒RNA。使用豬繁殖與呼吸綜合征病毒熒光PCR試劑盒檢測(cè)PRRSV 核酸，具體步驟按豬繁殖與呼吸綜合征病毒熒光PCR 試劑盒使用說明書操作。判定標(biāo)準(zhǔn)：陽性結(jié)果擴(kuò)增曲線在FAM 檢測(cè)通道有擴(kuò)增曲線且Ct 值≤38，陰性結(jié)果擴(kuò)增曲線在FAM檢測(cè)通道無擴(kuò)增曲線且Ct 值＞38。

3）測(cè)序。將經(jīng)PCR 鑒定PRRSV 病毒核酸為陽性的樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物送往福州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

4）序列分析。登錄GenBank，使用DNAstar 軟件對(duì)發(fā)表于GenBank 中18 株P(guān)RRSV 毒株的基因序列進(jìn)行同源性分析，并利用MEGA4.0 制作演變進(jìn)化樹。

圖1 血清學(xué)結(jié)果

表1 不同臨床表現(xiàn)的母豬和流產(chǎn)胎兒的熒光PCR 檢測(cè)結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 不同臨床表現(xiàn)母豬的檢測(cè)結(jié)果

從血清學(xué)結(jié)果可知（圖1），健康母豬、有淚斑或出血點(diǎn)的母豬、近期流產(chǎn)的母豬的抗體水平差異并不明顯。分子生物學(xué)結(jié)果顯示（表1），正常母豬血液、流產(chǎn)母豬血液和4 頭流產(chǎn)胎兒的組織內(nèi)均未檢測(cè)出PRRSV 核酸，而有淚斑或出血點(diǎn)的母豬血液檢測(cè)出PRRSV 核酸，推斷此次流產(chǎn)可能不是由PRRS 導(dǎo)致，而臨床表現(xiàn)為淚斑或出血點(diǎn)母豬與PRRSV 感染存在一定的關(guān)聯(lián)性。

2.2 不同階段仔豬的檢測(cè)結(jié)果

從血清學(xué)結(jié)果可知（圖2），產(chǎn)床正常的仔豬、產(chǎn)床上病弱豬、斷奶7 d 后正常豬、斷奶7 d 后弱豬、斷奶30 d 弱豬、斷奶60 d 弱豬都處于一個(gè)較高的抗體水平，5 頭斷奶7 d 后正常豬中有3 頭抗體為陰性，而斷奶7 d 后的弱豬抗體為陽性且抗體水平顯著高于斷奶7 d 后正常豬，初步推測(cè)可能由于PRRSV 的感染而導(dǎo)致仔豬病弱。結(jié)合分子生物學(xué)結(jié)果（表2），產(chǎn)床上病弱豬、斷奶7 d 后弱豬、斷奶30 d 弱豬、斷奶60 d 弱豬的血液中均檢測(cè)到PRRSV 核酸，加之產(chǎn)床上正常豬的分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果為陰性，進(jìn)一步說明病弱仔豬與繁殖與呼吸綜合征病毒感染有很強(qiáng)的相關(guān)性。

2.3 序列分析結(jié)果

通過測(cè)序發(fā)現(xiàn)檢測(cè)的毒株與GenBank 中18 株P(guān)RRSV 毒株的同源性在63.9%～97.2%（圖3 和圖4）， 其 與 15LY02-FJ、GD、HEB1、CH-1a-1996、HUN4、JXA1-2006、TJ、2015JL-102、HENZK-1 毒株的同源性＞90%；與2015JL-102、HENZK-1、JXA1-2006 的同源性最為接近。

圖2 不同階段的正常仔豬和病弱仔豬抗體檢測(cè)結(jié)果

表2 不同階段的正常仔豬和病弱仔豬熒光PCR 檢測(cè)結(jié)果

圖3 檢測(cè)毒株與18 株P(guān)RRSV 毒株同源性比對(duì)結(jié)果

圖4 檢測(cè)毒株與18 株P(guān)RRSV 毒株遺傳進(jìn)化樹分析

3 討 論

1）PRRS 是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引發(fā)的病毒性傳染病，臨床以妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障礙，仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征；豬群感染該病后容易導(dǎo)致免疫抑制而繼發(fā)其他疾病，是近年來嚴(yán)重危害國內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)的重大豬傳染病之一[2]。

2）該病的診斷常采用病毒分離鑒定、病原檢測(cè)、血清抗體檢測(cè)以及分子生物學(xué)檢測(cè)[3]等方法，對(duì)這起疑似病例采用血清抗體檢測(cè)以及分子生物學(xué)檢測(cè)進(jìn)行診斷，結(jié)果可知，流產(chǎn)母豬PRRS 抗體與健康豬群并沒很大區(qū)別，PRRSV 核酸也呈陰性，推斷此次流產(chǎn)可能與PRRS 無直接聯(lián)系，建議考慮飼養(yǎng)管理方面或者可篩查衣原體、偽狂犬等疾病。

3）疑似病例中5 頭斷奶7 d 的健康豬中有3 頭的PRRS 抗體呈現(xiàn)陰性，2 頭PRRS 抗體呈現(xiàn)陽性，同時(shí)5 頭的混合血樣PRRSV 核酸呈陽性，推測(cè)可能是2 頭陽性豬已被PRRSV 感染，還未表現(xiàn)出臨床癥狀；同階段的病豬變得病弱，說明斷奶7 d 的健康豬群正在面臨PRRSV 的威脅。

4）研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV 持續(xù)不斷的演化而導(dǎo)致其毒力增強(qiáng)與難以針對(duì)單一不變的基因型免疫，這些都?xì)w咎于PRRSV 是RNA 病毒。PRRSV 的基因組全長約15 kb，至少編碼10 個(gè)ORFs，其中ORF5基因編碼一種分子質(zhì)量在15～25 kμ 的跨膜糖基化蛋白（GP5 蛋白）[2]，并且ORF5基因被學(xué)者們認(rèn)為是分子進(jìn)化與分析遺傳變異的關(guān)鍵靶標(biāo)。本文通過測(cè)序比對(duì)致病毒株與其他18 株P(guān)RRSV 毒株的ORF5基因，發(fā)現(xiàn)2015JL-102、HENZK-1、JXA1-2006 的同源性最為接近[4]，HENZK-1 是由HP-PRRSV 疫苗株JXA1-R 演化而來。本病無特效藥物療法，免疫是預(yù)防疫病發(fā)生的有效手段，建議該場(chǎng)更換疫苗株JXA1-R 進(jìn)行免疫；同時(shí)制定合理的免疫程序，并定期開展抗體水平監(jiān)測(cè)和病原學(xué)監(jiān)測(cè)。