2018 年廣西活禽市場雞新城疫病毒病原學監測

曾婷婷 謝芝勛 謝麗基 謝志勤 張艷芳 黃嬌玲張民秀 范 晴 羅思思 王 盛

廣西壯族自治區獸醫研究所，南寧530001

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）強毒株感染引起的一種烈性傳染病，是世界動物衛生組織（OIE）規定的必須通報的疫病之一。NDV 宿主范圍廣泛，目前發現超過250 種禽類可以感染NDV。在世界范圍內已發生過4 次大規模的新城疫暴發，每次都伴隨著新的基因型和新的感染宿主出現。因此，對NDV流行毒株進行病原學監測和分子流行病學信息跟蹤是防控NDV 的重要內容。為了解NDV 在活禽市場的雞群中的感染情況，2018 年本實驗室從廣西境內10 個活禽市場采集雞咽喉和泄殖腔拭子共705份，進行病毒分離鑒定，并擴增和分析13 份HI 試驗陽性樣品的NDVF基因，旨在為雞NDV 的流行病學提供研究材料和依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

1.2 方 法

病毒分離方法和基因擴增、克隆、測序參考謝麗基等[1]。設計4 對引物擴增NDVF基因，FGENE 1 和FGENE 2 擴增產物拼接可得到NDV CLASS ⅠF基因全長，FGENE 3 和FGENE 4 擴增產物拼接可得到NDV CLASS ⅡF基因全長（引物見表1）。

1.3 F 基因遺傳進化分析

根據測序結果，推導出NDV分離株F基因的氨基酸序列，確定aa112～aa117 裂解位點基序。參照Gen-Bank 中相關序列，利用MEGA 6 軟件對F基因序列進行系統進化分析，采用neighbor joining test（Maximum Composite Likelihood 模型）構建系統遺傳進化樹[2]。

表1 引物序列

2 結果與分析

2.1 病毒分離結果

經過SPF 雞胚病毒分離和NDV 標準血清HI試驗，結果共有13 份尿囊液為NDV HI 試驗陽性。

2.2 F 基因擴增和比對分析

13 份NDVF基因擴增和測序后，blast 比對發現，分離株全部為CLASS Ⅰ基因1 b 亞型NDV。根據FO 蛋白裂解位點112-117 位氨基酸序列推測該毒株的致病性[3]，所有分離獲得的CLASS Ⅰ基因1 b亞型NDV 均為弱毒株。

2.3 F 基因的遺傳進化分析

圖1 NDV F 基因系統進化樹

根據Diel 等[2]提出的新的NDV 基因分型方法，采用F基因全長，構建進化樹。結果顯示，與blast 結果相符，獲取的13 個NDVF基因序列均歸屬于CLASS Ⅰ基因1 b 亞型分支（圖1）。

3 討 論

NDV 只有1 個血清型，但根據病毒F基因高變區序列差異可將毒株分為兩類：Ⅰ類（CLASS Ⅰ）和Ⅱ類（CLASS Ⅱ）。目前全世界范圍內暴發的ND 流行毒株和常用疫苗株均屬于CLASS Ⅱ，至少包含Ⅰ-XVIII 18 個基因型。CLASS ⅠNDV 在2003 年首次從法國野生麻鴨中分離得到[4]，隨后也在中國被陸續報道[5]。CLASS ⅠNDV 絕大多數為無毒株或弱毒株，目前僅分離到2 個CLASS Ⅰ強毒株[6-7]，但CLASS ⅠNDV 可在雞或雞胚中傳代增強毒力[8]。因此，在進行NDV 病原學監測時，對CLASS ⅠNDV 的監測也是重要內容。

本研究中，從705 份雞的咽喉/泄殖腔棉拭子中分離到13 個NDV 毒株，分離率為1.84%，與本實驗室2017 年的監測結果相似[1]。分析這些毒株的F基因序列發現，13 個NDV 毒株均為CLASS ⅠNDV。CLASS ⅠNDV 在發現前期主要分布于水鳥、海鳥和水禽[9]，本研究結果表明，CLASS ⅠNDV已經由水禽向陸生禽類傳播，這與王靜靜等[10]的研究結果相似。

根據Diel 提出的新的NDV 基因分型方法，CLASS ⅠNDV 只有1 個基因型，含1 a、1 b、1 c 3 個基因亞型[4]。使用這13 個NDV 分離株的F基因核苷酸序列與參考毒株繪制系統進化樹，全部屬于CLASS Ⅰ1 b NDV。但這13 個毒株與CLASS Ⅰ1 b NDV 參考株分別位于2 個小分支，具有地域特征。說明NDV 在流行傳播的過程中，在不同地區也形成了自己的分子特征。后續還將對這些毒株進行致病性試驗和全基因序列測定，為Ⅰ類NDV 的流行傳播規律、病原學和分子特征提供更多數據。