奶牛結核病不同檢疫方法比較

路廣計 王曉芳 馬宏偉 張 濤 范京慧 劉天駒 軒秋燕范葶莉 邵麗瑋 程麗華 邊青巖

1.河北省動物疫病預防控制中心，石家莊050000；2.河北省畜牧獸醫研究所，河北保定071000；3.河北省石家莊市動物疫病預防控制中心，石家莊050000；4.河北農業大學，河北保定071000；5.滄州職業技術學院，河北滄州061000；6.河北省饒陽縣農業農村局，河北饒陽053900

牛結核病主要是由牛型結核分支桿菌引起的一種人畜共患、慢性、消耗性傳染病，病原菌可通過空氣、接觸或牛奶感染人畜，嚴重威脅著動物和人類健康[1]。牛結核病的監測和凈化在活畜上需要依賴快速、敏感、特異性強的診斷方法。目前廣泛應用的診斷方法主要包括結核菌素皮內變態反應（TST）、歐盟皮內比較變態反應試驗（SICTT）和牛γ干擾素酶聯免疫吸附試驗（IFN-γ-ELISA）。TST 作為OIE 指定法定檢疫方法，優點是敏感性高，但操作費時費力，特異性差，容易出現假陽性或早期感染易漏檢[2-3]。SICTT 是TST 方法的改進，可排除檢疫中禽結核干擾導致的非特異性變態反應的影響，以避免不必要的淘汰和損失，目前歐盟等國普遍作為活畜檢疫確認試驗[4]。IFN-γ-ELISA 檢測試劑盒是外周血γ- 干擾素體外釋放檢測法在實際中的應用，操作簡單、敏感性和特異性高，目前已經得到全世界的廣泛認可[5]。本研究同時采用以上3 種方法對河北省石家莊市欒城縣某奶牛場進行平行檢測，比較不同檢疫方法對奶牛結核病陽性率的影響，為今后檢疫和奶牛結核病的凈化提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）試驗奶牛。中國荷斯坦奶牛300 頭，試驗奶牛外觀健康，無任何結核病臨床癥狀，統一TMR 飼喂，自由飲水。

2）主要試劑。牛型提純結核菌素（牛PPD，青島瑞爾生物技術有限公司，批號：P201906-001）；禽型結核菌素（禽PPD，青島瑞爾生物技術有限公司，批號：P201906-001）；牛結核分枝桿菌IFN-γ 檢測試劑盒（青島瑞爾生物技術有限公司，批號：P201906-001）。

3）器材。剃毛刀、注射器、游標卡尺、酶標儀，CO2培養箱、細胞培養板、肝素鈉采血管、移液器、槍頭等。

1.2 方 法

3 種方法同時進行，在頸部右側進行SICTT試驗，同時尾根靜脈采血進行IFN-γ-ELISA 試驗。

1）SICTT。參照《動物結核病診斷技術》（GB/T18645-2002） 操作，采用牛型PPD、禽型PPD，統一在牛頸部右側分點皮內注射，2 個注射點間隔12～15 cm。注射量分別為牛PPD 0.1 mL/頭（2 000 IU），禽型PPD 0.1 mL/頭（2 500 IU）。注射前剃毛、測量初始皮皺厚，注射后72 h 測量反應皮皺厚。注射前和試驗測量由專人完成。

2）IFN-γ-ELISA。尾根采血于肝素鈉抗凝管中，8 h 內送實驗室，嚴格按照IFN-γ-ELISA 試劑盒說明書操作并測定和記錄OD 值。

1.3 結果判定

1）TST判定。陽性：局部有明顯的炎性反應，皮厚差≥4.0 mm為陽性；可疑：2.0 mm≤皮厚差＜4.0 mm；陰性：皮厚差＜2.0 mm。

2）SICTT 結果判定。先按照TST 標準判定。陽性：牛型PPD 反應陽性，牛型PPD 皮厚差－禽型PPD 皮厚差≥4 mm；可疑：牛型PPD 反應陽性，1.0 mm＜牛型PPD 皮厚差－禽型PPD 皮厚差＜4.0 mm；陰性：牛型PPD 反應是陽性或陰性，牛型PPD 皮厚差≤禽型PPD。

3）IFN-γ-ELISA。牛結核陽性：牛型OD 值－禽型OD 值≥0.1，且牛型OD 值－PBSOD 值≥0.1。牛結核陰性：牛型OD 值－禽型OD 值＜0.1 或牛型OD 值－PB 的SOD 值＜0.1。禽結核陽性：禽型OD值≥牛型OD 值，且禽型OD 值－PBSOD 值≥0.1。

2 結果與分析

2.1 牛TST、SICIT、IFN-γ-ELISA 試驗結果

由表1 可知，牛TST 檢測陽性103 頭，陽性率為34.3%；SICTT 檢測陽性牛93 頭，陽性率為31%；IFN-γ-ELISA 檢測陽性牛153 頭，陽性率為51%。

2.2 3 種不同檢測方法陽性檢出率的對比分析

從表2- 表4 的檢測結果統計可以看出，TST 和SICTT 檢測相比，均為陽性的有93 頭，陽性符合率為94.89%；均為陰性的有197 頭，陰性符合率為97.52%。TST 與IFN-γ-ELISA 對比，均為陽性的有45 頭，陽性符合率為31.16%；均為陰性的有89 頭，陰性符合率為51.74%。SICTT 與IFN-γ-ELISA 對比，均為陽性的有40 頭，陽性率為38.83%；均為陰性的有94 頭，陰性符合率為53.10%。

表1 不同試驗方法檢測結果 頭

表2 TST 與SICTT 對比 頭

表3 TST 與IFN-γ-ELISA 對比 頭

表4 IFN-γ-ELISA 與SICTT 對比 頭

2.3 綜合對比分析

1）TST 判定為陽性牛的分析。如表5 所示，TST判定為陽性的牛共計103 頭，其中40 頭牛SICTT和IFN-γ-ELISA 均判定為牛型陽性，確定為陽性；34 頭SICTT 判定為陽性，IFN-γ-ELISA 判定為陰性，確定為陽性；19 頭牛SICTT 判定為陽性，SICTT判定禽陽性，確定為陽性（雙陽性）；1 頭牛SICTT 判定為可疑，IFN-γ-ELISA 判定為禽陽性，確定為陽性（雙陽性）；1 頭牛SICTT 判定為可疑，IFN-γ-ELISA 判定均為陰性，判定為陽性；2 頭牛SICTT 判定為陰性，IFN-γ-ELISA 判定均為陰性，確定為陰性；5 頭牛 SICTT 判定為陰性，IFN-γ-ELISA 判定為牛陽性，確定為陽性；1 頭牛SICTT 判定為陰性，IFN-γ-ELISA 判定為禽陽性，確定為陰性（禽陽性）。綜合判定，確定牛型結核陽性牛100 頭，陰性3 頭（禽型1 頭）。

表5 TST 判定為陽性牛

2）TST 判定為可疑牛的分析。如表6 所示，TST判定為可疑的牛共計19 頭，其中SICTT 判定可疑、IFN-γ-ELISA 判定牛型陽性牛4 頭，確定為陽性；SICTT 判定可疑、IFN-γ-ELISA 判定均為陰性牛7頭，確定為陰性；SICTT 判定可疑、IFN-γ-ELISA 判定為禽型陽性牛3 頭，確定為陰性（禽型）；SICTT 判定陰性、IFN-γ-ELISA 判定為牛型陽性牛2 頭，確定為陽性；SICTT 和IFN-γ-ELISA 判定均為陰性牛3 頭，確定為陰性。綜合判定，牛型結核陽性牛6頭，陰性13 頭（其中禽型3 頭）。

表6 TST 判定為可疑牛

3）TST 判定為陰性牛的分析。如表7 所示，TST判定為陰性的牛共計178 頭。其中，SICTT、IFN-γ-ELISA 判定均為可疑的牛61 頭，確定為陰性；SICTT 陰性、IFN-γ-ELISA 判定為禽陽性牛15頭，確定為陰性（禽型）；SICTT 判定陰性、IFN-γ-ELISA 判定為牛型陽性牛99 頭，確定為陽性；SICTT 判定可疑、IFN-γ-ELISA 判定為牛型陽性牛3 頭，確定為陽性。綜合判定，牛型結核陽性牛102 頭，陰性76 頭（其中禽型15 頭）。

4）綜合判定結果。綜上所述，檢測的300 頭牛共確定牛型結核陽性牛208 頭（其中20 頭雙陽），陰性92 頭（其中禽型19 頭）。牛型結核陽性率為69.33%，禽型結核陽性率為6.33%，二者混合感染率為6.66%。

3 討 論

本研究同時應用TST、SICTT 和IFN-γ-ELISA 3 種不同的檢測方法對試驗牛場進行牛結核篩查，綜合對比判定結果表明，試驗牛群結核病感染率達69.33%（208/300），感染類型既有牛型結核分枝桿菌感染，又有禽結核分枝桿菌感染，牛型結核陽性率、禽型結核陽性率、二者混合感染率分別為69.33%、6.33%、6.66%。

3 種方法檢測均為陽性的牛有40 頭，均為陰性的61 頭，總符合率僅為33.67%，說明每種檢測方法各有優缺點。TST 和SICTT 相比，陽性符合率為94.89%，符合程度較高，說明在本牛場的檢疫中其敏感性和特異性相差不大。 TST、SICTT 與IFN-γ-ELISA 相比，陽性符合率分別為31.16%和51.00%，陽性符合率較低。這是由于遲發型變態反應的滯后效應和人為誤差造成出現假陰性結果，致使其敏感性降低[6]。SICTT 雖然在TST 基礎上可有效排除部分因感染禽結核引起的假陽性，相對提高特異性，但敏感性仍不高。這與近年來國外多數研究結果相一致[7-8]。IFN-γ-ELISA 的敏感性和特異性均較高，操作簡單、快速，結果客觀、感染早期牛也可檢出；缺點是試劑成本較高，每份樣品50～100 元。

4 結 論

綜合分析，對于牛分枝桿菌感染率較高且有其他病原感染的牛群，可采用成本較低的TST 初篩，然后采用IFN-γ-ELISA 復檢以排除部分假陽性。鑒于IFN-γ-ELISA 可檢出早期感染牛，對于實施結核病凈化的牛場，按上述程序經過幾輪普檢后，可直接采用IFN-γ-ELISA 的方法進行檢測。