自組裝膜進樣質譜系統及其在砂質沉積物異化硝酸鹽還原研究中的應用

謝成軍，宋國棟，劉素美，唐繼堯，張桂玲

( 1. 中國海洋大學 海洋化學理論與工程技術教育部重點實驗室/海洋高等研究院，山東 青島 266100；2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋生態與環境科學功能實驗室，山東 青島 266237；3. 中國海洋大學 化學化工學院，山東 青島266100)

1 引言

氮是浮游植物生長的必要元素，在一定程度上限制著海洋的初級生產。然而，人類活動已經顯著影響到自然界原有的氮循環[1]，使得近岸海區遭受諸如富營養化、底層水體缺氧和酸化等一系列生態環境問題[2–4]。邊緣海沉積物是活性氮移除的主要場所，對于緩解近岸富營養化具有積極的意義[5]，同時對于評估全球海洋氮收支也至關重要[6]。沉積物中的活性氮移除主要依靠硝酸鹽的異化還原過程實現，這些過程包括厭氧銨氧化和反硝化，在這兩個過程中硝酸鹽經過一系列異化還原最終以N2形式移除，在厭氧銨氧化過程中銨氮也被移除；同時，在沉積物中還存在異化硝酸鹽還原為銨（Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium, DNRA）的過程，該過程僅僅是將硝酸鹽轉化為銨鹽，并未實現活性氮的移除[7]。因此，準確量化邊緣海沉積物中異化硝酸鹽還原各個過程的速率，就成為準確評估海洋氮收支的關鍵所在。

目前對于海洋沉積物異化硝酸鹽還原速率的測量，大部分的數據來源于泥質沉積物的研究，硝酸鹽在泥質沉積物間隙水中的獲取依靠擴散的途徑。而近期的研究結果表明，砂質沉積物可能也是反硝化過程進行的熱點區域，在這些沉積物中，硝酸鹽通過平流輸運進入沉積物，在發生反硝化時可能仍然處于氧化環境，這種反硝化被稱為好氧反硝化[8–9]。而對于邊緣海來說，大約50%～60%的區域被砂質沉積物覆蓋，如果在這些砂質沉積物中能夠發生好氧反硝化，則對于海洋氮循環的收支將會產生顯著的影響[10–11]。然而，好氧反硝化在砂質沉積物中是否普遍存在，目前的研究中還尚存爭議。

目前常用的測定沉積物異化硝酸鹽還原過程速率的方法是基于15N 標記的技術[12]。在這種技術中，加入厭氧的沉積物中進行培養實驗，然后在不同時間點取樣，測定產物中29N2、30N2和對于產物測試的儀器一般采用氣相色譜–同位素比值質譜[13–14]。該設備的成本在早期較高，這在一定程度上限制了該方法的推廣。相對于同位素比值質譜，膜進樣質譜是一種相對實惠且較為靈敏的一種小型質譜，已被國內外廣泛應用于水體中多種氣體的測定，如N2、O2和Ar 等[15–17]；該設備與15N 標記技術結合，不僅可以直接用來測定N2/Ar 從而直接計算N2產生的通量，而且也可以用來測量29N2和30N2，以及可以轉化為29N2和30N2的15N 標記產物，具有快速、靈活、所需樣品體積少等優點[15,18–19]，已經被許多氮循環研究學者用于沉積物或者水體中的反硝化、厭氧氨氧化以及DNRA，甚至沉積物固氮、礦化和銨同化等過程的研究[19–21]。國內的一些實驗室已經配備了膜進樣質譜，對于該設備的使用也有一定的介紹[16–17,21]，但大都是直接采購的商品化設備，成本依然較高，而且大多數的報道都沒有涉及到儀器使用條件的優化，或者原本膜進樣質譜的專門用途不適合15N 標記氣體樣品的測試，比如目前為走航用于水體的O2/Ar 測定的膜進樣質譜，儀器自帶的膜進樣器擴散面積較大，需要200 mL/min左右的流速方能維持穩定的信號[17]，顯然這并不適合小體積15N 標記氮氣樣品的測試。為此，在本研究中，我們利用現有的四極桿質譜儀，自行加工了由滲透性的硅膠薄膜管組成的膜進樣器，組裝了一套膜進樣質譜系統，測試并優化其性能，并利用該系統初步研究了青島石老人沙灘沉積物中異化硝酸鹽還原過程。

2 材料與方法

2.1 自組裝膜進樣質譜系統組成

圖1 展示了本研究自行組裝的膜進樣質譜系統。該系統主要由以下部件構成：樣品瓶(S)，進樣蠕動泵(P)，恒溫水浴槽(T)，標準樣品制作系統(R-E)，膜進樣器(M)，冷阱(C)，銅還原爐(F)，離子源(I)，四極桿質量分析器(Q，英國Hiden 公司HPR40)，二次電子倍增檢測器(SEM)和數據處理系統(D)。其中樣品瓶用于盛放樣品，我們選用國內外常用的Exetainer 瓶(6 mL或者12 mL，英國Labco 公司) 作為樣品瓶；蠕動泵(Minipuls 2，法國Gilson 公司)負責將樣品平穩地泵入膜進樣器，以便于將水樣中的溶解氣體進行分離。膜進樣器由滲透性的硅膠薄膜管組成(外徑0.9 mm，長度3 cm)，其構造類似Kana 等[15]的膜進樣器，該裝置由作者在實驗室自行加工而成。泵入膜進樣器水樣中的溶解的氣體在膜外高真空的吸引下擴散至四極桿質譜系統管路中，高真空的獲得由愛德華分子泵站實現，在測試時可維持10–7torr （1 torr=133.322 368 4 Pa）的真空度。為使水樣中的氣體能夠均勻地透過硅膠半透膜，將膜進樣器置于高精度(±0.01℃)恒溫水浴槽中，以便于獲得高精度的測試結果；此外，恒溫水浴槽的另外一個功能是用來制取標準水樣，即通過恒溫攪拌水樣使之與大氣達到溶解平衡實現[15,21]。經膜進樣器分離的氣體(包含空氣主要成分如N2、O2、Ar、CO2、H2O，以及15N 加富培養實驗所產生的15N-N2、15NN2O 等)進入液氮冷阱后被純化，一些高沸點的分子(如H2O、CO2、N2O 以及一些有機分子)在此被冷凍；經純化后的氣體主要含有N2(包含其同位素)、O2和Ar，然后氣體樣品繼續進入還原銅爐(內含裝有還原銅絲的石英管)，氧氣分子與高溫的銅絲反應被除去，以降低O2對測定30N2的干擾[22]。還原銅爐由石英玻璃管和可調溫管式爐(溫控范圍：室溫至1 000℃)組裝而成。隨后氣體樣品進入電離室，在此氣體分子被高溫釷化銥燈絲產生的高能電子流轟擊而離子化，不同質荷比(m/z)的離子被四極桿質量分析器分離后經二次電子倍增檢測器檢測，然后經過信號收集系統記錄信號傳輸到計算機進行處理。

圖 1 自組裝膜進樣質譜系統示意圖Fig. 1 Schematic diagram of self-assembled membrane injection mass spectrometry system

在使用之前我們首先對自組裝的膜進樣質譜系統的性能進行優化測試，這些測試包括系統的真空度，蠕動泵的進樣流速和進樣時間，進樣時恒溫槽的溫度以及在測試29N2/28N2和30N2/28N2比值時是否受氧氣影響。

2.2 蠕動泵進樣流速和進樣時間測試實驗

利用20℃下與空氣飽和的純水采用蠕動泵進樣，設定蠕動泵進樣流速為0.40 mL/min，進樣時間分別設定為2 min、2.5 min、3 min、3.5 min 和4 min，分別測定28N2、29N2和30N2的峰高值并計算對應的29N2/28N2和30N2/28N2的相對標準偏差，然后再更改蠕動泵流速分別為0.53 mL/min、0.67 mL/min、0.80 mL/min、0.93 mL/min 和1.07 mL/min，測試上述峰高值和對應的氣體同位素比值，然后綜合確定最佳的進樣流速和進樣時間。

2.3 進樣溫度測試

膜進樣器對于水樣中溶解氣體的擴散受到溫度的影響，一般說來，高溫有利于擴散的進行，而低溫會降低擴散速率。然而，溫度并不是越高越好，較高的溫度對于測試的精密度會產生一定的影響。將膜進樣器置于高精度恒溫槽中，分別利用10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和35℃下與空氣平衡的高純水進樣，時間為3.5 min，對比不同溫度下N2和Ar 的峰高值并計算對應的N2/Ar 的相對標準偏差，然后評估最佳的進樣溫度。

2.4 氧氣的干擾實驗

在測試系統中安裝銅還原爐。利用管式爐的升溫程序分別控制還原銅絲的溫度從室溫到800℃變化，以此來檢測進入質譜系統的氧氣信號值與常溫下的比較，并監測不同的加熱溫度下29N2/28N2和30N2/28N2的比值，以此來驗證在測試29N2/28N2和30N2/28N2時氧氣是否存在干擾。

2.5 石老人砂質沉積物15N 標記培養

為了探討在砂質沉積物中的異化硝酸鹽還原過程，于2017 年3 月在青島石老人沙灘(36°06′04″N，120°29′12″E)獲取砂質沉積物進行15N 標記的泥漿培養實驗。樣品采集后立即置于有冰袋的保溫盒中帶回實驗室，然后進行有氧和厭氧條件的培養實驗。對于厭氧培養，首先將混勻后的砂質沉積物裝入3 個避光的氣密性培養袋，加入氦氣除氧的海水，原位溫度預培養1 d，以消除培養體系中殘余的溶解氧和硝酸鹽(包括亞硝酸鹽)。預培養結束后，分別向3 個培養袋中加入不同的標記物質，分別是：(1)，(2)+和混勻，使標記物質最終的濃度均為100 μmol/L。然后原位溫度下培養8 h，分別在0 h、2 h、4 h、6 h 和8 h 利用注射器從培養袋中取樣，取樣前用手將培養袋混合均勻，待大顆粒物稍微沉降后，利用注射器抽取袋內泥漿樣品注入1 個6 mL Exetainer瓶中，然后加入0.1 mL 飽和HgCl2用于終止微生物反應，樣品避光倒置保存用于29N2、30N2以及的測定[23]。對于有氧培養實驗，將混勻后的砂質沉積物裝入避光的氣密性培養袋，然后加入原位底層海水，并排出培養袋中的氣泡，向培養袋加入使標記物質最終的濃度為100 μmol/L，混勻，原位溫度下培養10 h，分別在0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h 和10 h 利用注射器進行取樣，樣品采集后分別轉移至2 個6 mL Exetainer 瓶中，其中一個加入溶解氧固定劑，然后在24 h內用Winkler 法滴定其溶解氧含量[24]；另外一個加入0.1 mL 飽和HgCl2混勻加蓋旋緊避光保存用于29N2、30N2和的測定。29N2與30N2樣品的測試采用前面優化好條件的膜進樣質譜以直接進樣測試；測試采用堿性次溴酸鈉氧化法首先將轉化為29N2和30N2，然后再使用上述膜進樣質譜進行測定。樣品中29N2和30N2濃度的計算公式采用與Thamdrup 和Dalsgaard[25]類似的公式計算，

式中, ΔmN2表示29N2和30N2的產生 濃度；表 示29N2/28N2或者30N2/28N2比值；t0與ti分別表示培養實驗的時間零點和取樣時間點；表示ti時刻樣品中28N2的信號值；α 是轉化因子，即與空氣飽和的水中溶解的N2單位濃度在膜進樣質譜上產生的信號值。29N2和30N2的產率采用各自的濃度與時間的線性回歸斜率獲得；的濃度由轉化后測出的29N2和30N2的濃度返算而得[19,23]，的產率由濃度隨時間的線性回歸斜率獲得。15N 標記培養實驗的產物隨時間的變化采用單因素方差檢驗(One-way ANOVA)判斷其隨時間是否顯著增加，利用Sigmaplot 軟件完成。

3 結果與討論

3.1 進樣流速和進樣時間對信號的影響

實驗結果表明蠕動泵的進樣流速和進樣時間對于本實驗室組裝的膜進樣質譜系統的信號值均產生影響(圖2)。進樣時間從2.5 min 到4.0 min，氮氣的信號值均隨著蠕動泵進樣流速的增加而增加，在低泵速增加較快，在高泵速增加較為緩慢，在整個泵速范圍內，28N2信號的響應值變化不超過20%，在進樣流速0.80 mL/min 以上，無論進樣時間長短，28N2的信號值在±2%波動。不同的進樣時間在不同的蠕動泵進樣流速下信號的響應值差別并不明顯，說明2.5～4 min的進樣時間都可以滿足要求。29N2與30N2的信號值比28N2的信號值低2～3 個數量級，但均表現出與28N2類似的變化特征(圖略)。

而對于29N2/28N2，無論進樣時間長短，在中間進樣流速下波動性較小，尤其是在進樣流速為0.67～0.80 mL/min，進樣時間在3～3.5 min 時，29N2/28N2的精密度(以變異系數表示) 可以控制在0.1% 以內，0.93 mL/min 以上的進樣流速，29N2/28N2的精密度較差，這可能與進樣蠕動泵本身的波動有關。而對于30N2/28N2，整體上其波動性要高于29N2/28N2，進樣時間在3 min 以上，進樣流速在0.80～0.93 mL/min 時，30N2/28N2的精密度可以控制在1%以內(圖3)。30N2/28N2精密度與文獻報道的結果比較一致[26]，這可能與30N2容易受到14N16O 的干擾有關，盡管通過增加銅還原爐可以降低14N16O 對30N2的干擾，但并不能消除；此外，30N2/28N2的波動性還可能與四極桿質譜中離子源的使用年限有關，這在以往的研究中有所報道[26]，本實驗所采用的離子源已經使用了2 年之久，長時間的走航測試可能使得離子源在電離氣體分子時出現一些波動，如果采用新的離子源效果可能會有所改善。綜上，在本實驗系統下所選用的進樣流速為0.80 mL/min，進樣時間為3 min 時，29N2/28N2和30N2/28N2的精密度分別可以控制在0.1%和1%以內。

3.2 溫度對測試性能的影響

這里我們以N2的信號值和N2/Ar 比值的變異系數為指標來探討進樣溫度對測試性能的影響(圖4)。進樣溫度為10℃時，N2的信號值表現最低，15℃時開始升高，之后到30℃略有降低，35℃時又略微升高。在20℃以上，N2信號值總體的波動在正負1%以內，差別不大。而對于N2/Ar 的精密度來說，在20～25℃時變異系數最小，可達0.05%以下，而在15℃以下和30℃以上波動性略大。這樣，我們可以選擇20～25℃的恒溫水浴進行進樣以保證測試比值最優的精密度。溫度對于N2信號值的影響可以從兩個方面進行解釋：一是溫度對水中溶解氣體透過半透膜擴散性能的影響；二是溫度對氣體溶解度的影響。二者的影響作用是相反的，對于前者，溫度越高越有利于氣體的擴散，而對于后者，溫度越高，氣體在水中的溶解度越小。這樣在較低的溫度下盡管氣體的溶解度較大，但是擴散的影響可能占據主導地位導致N2信號響應值較低，而在中間溫度，二者的影響相互抵消，使得20～30℃之間N2信號響應值變化不大，而溫度進一步升高，盡管氣體的溶解度較低，但溫度的升高又導致擴散性能的提高使得透過硅膠半透膜的N2量增加，儀器所檢測到的N2信號有所升高。

圖 2 蠕動泵進樣流速與進樣時間對28N2 信號值的影響Fig. 2 Effect of peristaltic pump flow speed and injection time on the 28N2 signal value

圖 3 蠕動泵進樣流速和進樣時間對29N2/28N2 和30N2/28N2 的影響Fig. 3 Effect of peristaltic pump flow speed and injection time on 29N2/28N2 and 30N2/28N2

3.3 氧氣對測試的影響

氧氣對氮氣同位素測試的影響如圖5 所示。隨著銅還原爐從室溫(25℃)逐漸升高至200℃，氧氣被快速的除去，在300℃以上，氧氣的去除效率達到并保持在99.9%以上，說明利用銅還原爐加熱的方式可以有效地去除進樣氣體中的氧氣，這與以往文獻報道一致[27]。對于氮氣的3 種同位素來說，銅還原爐從室溫到800℃，28N2信號值基本保持不變，其波動僅為0.6%；29N2信號值從室溫到600℃基本保持不變(變異系數CV=0.6%)，而在700℃以上，29N2信號表現出略微的上升趨勢；30N2信號值隨著銅還原爐溫度的升高，表現出逐漸下降的趨勢，至300℃，30N2信號值降低至室溫值的70%，至600℃，基本保持在70%左右，這說明氧氣的去除有效地降低了離子源內因14N16O(質量數30)形成而對30N2檢測產生的干擾(ANOVA, P＜0.05)。600℃以上，30N2信號值急劇升高，這可能是由于在高溫下原來與Cu 反應生成的CuO 發生少量分解，產生的氧氣在離子源內與N 結合生成NO 之故，因此采用銅還原爐的最佳溫度在本系統以300～600℃為佳。有報道指出，不同的四極桿質譜的離子源構成對于O2干擾響應的程度也不一樣[22,27–28]，對于新組裝或新購置的膜進樣質譜如果用于15N 標記的29N2和30N2的測量，我們建議進行氧氣干擾實驗以便確定合適的銅還原爐的使用溫度。

3.4 石老人沙灘沉積物異化硝酸鹽還原過程

4 結論

圖 4 不同進樣溫度下N2 的信號值和N2/Ar 的變異系數Fig. 4 Signal value of N2 and coefficient of variation of N2/Ar at different temperatures

圖 5 銅還原爐溫度對于氧氣移除效率和N2 同位素測定信號的影響Fig. 5 Effect of copper reduction furnace temperature on the oxygen removal efficiency and the signal of nitrogen isotope

本研究自行組裝了膜進樣質譜系統，并測試優化了該系統的工作條件，利用該系統結合15N 標記技術測定了青島石老人沙灘沉積物的異化硝酸鹽還原過程，得到的認識如下：

(1)利用自組裝的膜進樣質譜系統可以用來測定15N 標記的29N2和30N2，在常溫下進樣即可，所需進樣時間較短，測量29N2/28N2和30N2/28N2的精密度分別可以控制在0.1%和1%以內，僅需2 mL 左右的樣品即可實現一次測量，非常適合15N 標記的小體積樣品的測量。

(2)水樣中溶解的氧氣對于30N2信號的測量有顯著影響(ANOVA, P＜0.05)，采用加熱的銅還原爐可以有效的降低氧氣的影響，對于銅還原爐的最佳溫度可以通過實驗進行確定，本組裝系統以300～600℃為佳。

(3)對于石老人沙灘沉積物來說同時存在著厭氧反硝化、厭氧銨氧化和DNRA，而不存在將硝酸鹽完全還原為氮氣好氧的反硝化。厭氧銨氧化、厭氧反硝化和DNRA 的潛在速率(以濕沉積物N 計)分別為(0.05±0.01) nmol/(cm3·h)，(2.32±0.21) nmol/(cm3·h)和(1.02±0.15) nmol/(cm3·h) 。厭氧反硝化是異化硝酸鹽還原的主要過程，其貢獻比高達近70%，其次是DNRA，貢獻約30%，而厭氧銨氧化的貢獻不足1%；在N2移除過程中，厭氧反硝化是主要的控制過程，貢獻高達98%，厭氧銨氧化的貢獻僅為2%。

圖 7 有氧條件下石老人沙灘沉積物添加 培養體系中DO、29N2 和30N2 的變化Fig. 7 Changes of DO, 29N2 and 30N2 in culture system of sediment in Shilaoren Beach under aerobic conditions

致謝：感謝海洋化學理論與工程技術教育部重點實驗室張海龍高級實驗師和寧曉燕實驗師在組裝膜進樣質譜系統管路選材方面給予的幫助和建議。感謝鄭文靜和秦川同學在四極桿質譜儀使用方面給予的幫助。