正交試驗設計優化近紅外檢測牛乳中蛋白質的建模條件

彭 丹，劉亞麗，李林青，畢艷蘭

（河南工業大學糧油食品學院，河南 鄭州 450001）

蛋白質作為生命的物質基礎，在生理功能調節中起著重要作用。牛乳是提供人體蛋白質的重要途徑之一，已成為人們生活中的必需品。國家標準中明確規定了牛乳中蛋白質含量的最低要求，如《巴氏殺菌乳》《滅菌乳》中蛋白質含量不得低于2.9%。近年來，有關乳品中蛋白質含量不達標的事件時有發生，一些不法商販向乳品中添加高氮物質如三聚氰胺等提高蛋白質含量牟取利益，嚴重影響乳品行業的發展和消費者的身體健康，引起了社會關注，也對質監部門和檢驗工作者提出了更高的要求，即尋找快速、準確檢測乳品中蛋白質含量的方法。

目前，常用的蛋白質檢測方法有凱氏定氮法、紫外吸收法[1]、電泳法[2]、低場核磁共振法[3]和近紅外光譜法[4-7]等。凱氏定氮法是通過測量總氮量計算得到蛋白質的含量，該方法測量準確，但操作復雜、費時長；紫外吸收法具有簡便、靈敏等優點，但分析精度不高，干擾物質較多；近年來出現的電泳法、低場核磁共振法等檢測準確、快速，然而這些方法還不夠成熟。相比其他方法，近紅外光譜法具有快速、無損、可在線檢測等特點，已廣泛應用于食品、農業、化工和制藥領域中[8-12]。近紅外光譜技術屬于間接分析方法，需要通過多元校正方法建立光譜信息與待測成分間的關聯，由于儀器性能、外界環境、自身特性等因素影響，使得光譜數據中往往含有共線性、噪聲及外界干擾信息等，導致建模結果誤差較大甚至無法使用，故此需要優化條件。目前，在乳蛋白質檢測中主要開展了3 個方面的研究：1）通過不同測量方式檢測乳品中蛋白質含量，對于含有懸浮顆粒的液體，多采用漫透射[13]或漫反射[14-15]方式進行測量；2）選擇不同特征波段開展蛋白質含量檢測[16]，如短波段（780～1 100 nm）、中波段（1 100～1 700 nm）和長波段（1 700～2 500 nm）等，以此剔除冗余信息，增強檢測的針對性；3）確定蛋白質檢測的最佳化學計量學方法，包括預處理方法[17-18]和建模方法[19-20]。由于牛乳介質中存在顆粒不均勻性，使其對近紅外光譜有很強的散射作用，多采用正交信號校正、多元散射校正、求導等對光譜進行處理。在已有的建模條件研究中往往只考慮某一方面的優化，而實際問題中各因素完全獨立的情況極為少見。因此，本實驗針對各因素間存在相互作用影響的情況，在單一建模條件研究的基礎上，運用正交試驗設計對建模條件進行優化，建立一個準確度高、重復性好、適用于牛乳蛋白質含量分析的優化檢測體系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用的牛乳均來自廠家直營店。為使蛋白質含量在較大范圍內變化，采取添加蛋白粉的方式，并對樣品進行均質操作以保證樣品的均勻性和穩定性，共得到180 個樣本。通過K-S方法選取135 個樣本的光譜數據作為校正集，其余45 個樣本的光譜數據作為驗證集。

1.2 儀器與設備

XDS型近紅外光譜儀 丹麥FOSS公司；ZS90粒度電位分析儀 英國Malvern公司；AH-Pilot高壓均質機德國APV公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質含量的測定

參考GB 5009.5ü2016《食品中蛋白質的測定》測定。

1.3.2 近紅外光譜檢測

采用XDS型近紅外光譜儀對樣品的吸收光譜進行測試，光譜采集范圍780～2 500 nm，掃描次數32 次，分辨率2 nm，檢測器為硅（780～1 100 nm）和硫化鉛（1 100～2 500 nm）。

1.3.3 光譜數據處理

以蛋白質含量為外部微擾，進行二維相關同步譜和自相關譜解析，尋找與蛋白質含量相關的敏感波段。具體過程：1）依據蛋白質含量的真實值，從小到大順序均勻選取10 個代表性樣品用于一維近紅外牛乳光譜的測量；2）采用正交信號校正對測得的光譜進行預處理，消除與被測成分無關的光譜信息；3）根據二維相關光譜理論，對處理后的一維光譜進行分析、計算，獲得其二維相關同步譜及自相關譜；4）通過解析二維相關同步譜和自相關譜，確定與蛋白質含量相關的最佳光譜波段。上述二維相關光譜計算過程利用Matlab R2018a軟件完成。

利用CAMO公司的Unscrambler 10.5軟件對光譜進行預處理，分別建立多元線性回歸（multiple linear regression，MLR）、主成分回歸（principal component regression，PCR）、偏最小二乘（partial least squares，PLS）法和支持向量機（support vector regression，SVR）校正模型，模型性能通過決定系數（R2）、校正均方根誤差（root mean square error of calibration，RMSEC）和預測均方根誤差（root mean square error of prediction，RMSEP）評價。

1.3.4 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，選取檢測波段、預處理方法和建模方法為考察因素，以目標函數F[21]為評價指標，采用L16（45）正交表進行試驗設計，確定蛋白質含量最佳的建模條件。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used for orthogonal array design

1.4 數據統計

采用Matlab R2018a、Origin 9.0軟件和Excel 2016軟件進行數據統計和圖表繪制，利用SPSS 22.0軟件對數據進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 牛乳近紅外光譜及二維相關分析

圖1 牛乳的近紅外光譜圖Fig. 1 NIR spectra of milk samples

如圖1所示，脂肪、蛋白質和乳糖等成分近紅外吸收分布于整個光譜區域，且相互重疊。在1 460、1 974 nm波長附近有2 個主要吸收峰，分別為牛乳中水、蛋白質、脂肪和乳糖等成分的結構和組成信息。其中，1 460 nm波長處與—OH、—NH2等基團的倍頻吸收有關[22]，1 974 nm波長處為水的吸收信息。為確定蛋白質的主要吸收位置，以蛋白質含量為外擾，對牛乳近紅外光譜進行同步二維相關分析，結果如圖2所示。

圖2 牛乳二維近紅外光譜相關同步譜（a）和自相關譜（b）Fig. 2 Two-dimensional correlation spectra of samples (a) and autocorrelation spectrum (b)

圖2 a中的峰有自相關峰和交叉峰兩類，位于對角線上的峰為自相關峰，位于對角線外為交叉峰。自相關峰的強度反映了不同波長下光譜信號隨外部擾動變化的程度[23-25]，即對蛋白質含量變化的敏感程度，其值均為正；交叉峰則表示不同波長下光譜強度變化的相似性，其值有正有負。自相關譜是由對角線上自相關峰構成的譜圖（圖2b）。由圖2可以看出，在波長978、1 164、1 420、1 524、1 659、1 860 nm和2 238 nm處存在較強的自相關峰，其中2 238 nm處的自相關峰與蛋白質有關；在主對角線以外，在（1 420 nm，1 860 nm）、（1 860 nm，2 238 nm）、（1 420 nm，2 238 nm）、（1 524 nm，2 238 nm）位置處存在明顯正交叉峰，表明波長1 420、1 524、1 860 nm和2 238 nm處的吸收峰來源相同，均是由蛋白肽鍵和氨基中NüH鍵對光譜吸收形成[26]。可見，1 400～2 300 nm波段的光譜隨蛋白質含量變化極顯著。該波段與Kalinin等[27]牛乳蛋白質測量所用的光譜區域（800～1 065 nm）有所不同，這可能與測量方式、儀器硬件等有關，本實驗采用了漫反射方式測量牛乳蛋白質含量，而文獻[27]中利用了透射方式。雖然短波區域（780～1 100 nm）的光透射性強，但吸收系數較小[28]，與長波相比蛋白質含量信息量相對較少（圖2b），增加了數據分析和建模的難度，結合二維相關分析，本研究選擇波段1 400～2 300 nm作為蛋白質檢測的研究區域。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 預處理方法的對比

為降低干擾信息的影響和提升模型預測精度，分別采用矢量歸一化、多元散射校正（multiplicative scatter correction，MSC）、一階導數（1st）、二階導數（2nd）、標準正態變量變換（standard normal variate，SNV）方法對原始光譜進行預處理后建立PLS模型，結果如表2所示。除2nd方法外，矢量歸一化、MSC、1st、SNV方法處理后模型的相關系數和預測準確性均有明顯提高，表明這4 種方法能夠扣除光譜中與待測成分無關的干擾信號，保留有用信息。其中，經SNV法處理后的蛋白質模型的預測效果最佳，其次為MSC法。與預處理前相比，經SNV法和MSC法處理后模型的RMSEP分別降低了31.1%和27.8%。通過粒徑分析可知，均質后牛乳中脂肪球的粒徑分布于0.2～1.0 μm之間，存在明顯脂肪球分布的不均勻性，這使其對近紅外光有較強的散射作用[29]，由于MSC法和SNV法能夠消除顆粒大小及均勻性變化對光譜的影響，所以經MSC法和SNV法處理后可有效消除散射作用引起的干擾。相反，2nd法在去除背景干擾、提高靈敏度的同時放大了噪聲，降低了信噪比，使得模型的預測能力下降，導致RMSEP升高了91.9%。可見，預處理方法的選擇對蛋白質檢測結果有較大影響，其中MSC和SNV是較為理想的預處理方法。

表2 預處理方法的比較Table 2 Comparison of results obtained with different preprocessing methods

2.2.2 波段選擇的影響

圖3 不同波段牛乳中蛋白質含量的預測Fig. 3 Effect of different wavelength regions on prediction of protein concentration in milk

選擇與待測組分相關的特征波段，既能降低計算量、提高模型的預測能力和穩健性，又能避免光譜數據間相關性導致的過擬合現象。本實驗在1 400～2 300 nm波長范圍內研究不同波段對蛋白質含量檢測的影響。如圖3所示，3 個波段1 400～2 300、1 400～1 800 nm和1 800～2 300 nm的RMSEP分別為0.146、0.142和0.125，其中1 800～2 300 nm波段的預測結果明顯好于其他波段，這與Tsenkova等[30]的研究結果基本一致，可見1 800～2 300 nm波段內含有較強的蛋白質含量信息。雖然1 400～1 800 nm波段也含有蛋白質相關的光譜信息，但是由于存在脂肪較強的散射作用和水的強吸收作用，加之牛乳中水的含量（＞87%）遠大于蛋白質，使得此波段存在復雜的背景干擾。因此，1 800～2 300 nm是蛋白質理想的檢測波段。

2.2.3 建模方法比較

圖4 不同建模方法牛乳中蛋白質含量的預測結果Fig. 4 Effect of different modeling methods on prediction of protein concentration in milk

采用MLR、PCR、PLS和SVR對同一牛乳樣本進行定量分析，結果如圖4所示。4 種建模方法中線性校正方法明顯好于非線性，且線性建模方法中PLS法和PCR法對蛋白質的預測性能均優于MLR法。這可能是因為1 800～2 300 nm范圍內自變量（光譜數據）與被測目標（蛋白質含量）間不僅有較強的線性關系，同時光譜數據內部存在多重共線性的現象，使得MLR建模方法失效。而PLS和PCR法能夠對光譜數據進行分解和篩選，剔除多重相關信息和無解釋意義信息的干擾；SVR法作為非線性定量校正方法，其原理是通過升維方式使原樣本空間中的非線性問題轉化為特征空間中的線性關系進行建模，但是對于樣本空間中線性問題使用SVR法會增加計算的復雜性，甚至引起“維數災難”，導致模型的預測精度降低。由圖4可知，PLS法和PCR法建立的蛋白質校正模型的預測結果相差不大，RMSEP分別為0.125和0.132。因此，PLS法和PCR法均適合作為蛋白質檢測的建模方法。

2.3 正交試驗結果

在實際應用中，由于近紅外吸收光弱且易受外界干擾，光譜中夾雜許多無用信息（包括噪聲、背景等），為提高信噪比、建立穩定的校正模型，需要對光譜數據進行波段、預處理和建模方法的優選組合。本實驗選取預處理方法、檢測波段和建模方法3 個因素進行正交試驗，以F值作為評價指標，F值越大表明模型的性能越好。經方差分析，以上3 個因素對模型的預測精度存在一定交互作用的影響。由表3可知，影響蛋白質模型預測精度的主次因素為建模方法＞檢測波段＞預處理方法；根據極值分析結果，得到各因素的較好水平組合為A2B3C1，即建模方法為PCR法、檢測波段為1 800～2 300 nm、預處理方法為MSC法，這與單因素試驗結果并不完全一致，且A2B3C1沒有出現于正交試驗設計方案中，這可能與預處理方法、建模方法2 個因素間的交互作用影響有關。為了確定最佳建模條件，分別在A2B3C1、單因素試驗以及正交設計試驗中最優建模條件下對未知樣品進行檢測，結果表明A2B3C1條件下的預測效果最好，其R2、RMSEP分別為0.993、0.106。可見，經正交試驗設計確定的建模條件能夠進一步提高蛋白質模型的準確度，也表明正交設計能夠有效優化復雜背景下的近紅外建模條件。

表3 正交試驗設計與結果Table 3 Orthogonal array design with results

3 結 論

建模條件的選擇直接影響近紅外光譜分析結果。本實驗以復雜背景條件下的蛋白質為研究對象，采用近紅外光譜技術對牛乳中蛋白質含量進行檢測，通過正交試驗設計優化近紅外建模條件，即預處理方法、檢測波段和建模方法。結果表明，與傳統方法對比，該方法不僅避免了各建模條件存在交互作用的影響，覆蓋了主要因素的各種組合，而且以較少實驗次數得到了預測準確度較高的分析模型，為近紅外蛋白質含量建模條件優選提供了一條有效的途徑。