菠蘿皮渣生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)高菌體蛋白飼料發(fā)酵菌種的篩選及發(fā)酵條件的優(yōu)化

陳間美，李晉禎，何曉彤，王 玲

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江 524088）

0 引言

菠蘿（Ananas comosus），又名鳳梨，含有豐富的糖分、多種維生素和礦物質(zhì)，廣泛分布于我國的廣東、廣西、云南等地。廣東西部的湛江是我國菠蘿的集中種植區(qū)，且產(chǎn)量大、品質(zhì)好。目前，菠蘿加工的主要產(chǎn)品有罐頭、果醬和果汁等，菠蘿在加工的過程中會產(chǎn)生高達(dá)50%～60%的菠蘿皮渣。目前菠蘿皮渣僅有一小部分被直接利用作為飼料，絕大部分作為廢物丟棄，既浪費(fèi)資源又對環(huán)境造成污染[1]。菠蘿皮渣含有豐富的營養(yǎng)成分，經(jīng)過微生物發(fā)酵后可以提高其蛋白含量作為動物飼料[2]。王玲等人[3]用菠蘿皮渣釀制果醋。Contreras A等人[4]在奶山羊的飼料中添加菠蘿皮渣提取的菠蘿蛋白酶，改善了乳品質(zhì)。梁耀開等人[5]發(fā)現(xiàn)，菠蘿皮渣混合菌種發(fā)酵可生產(chǎn)出高蛋白的畜禽飼料。葉盛權(quán)等人[6]成功開發(fā)出菠蘿皮渣飼料添加劑。

研究旨在對利用菠蘿皮渣生產(chǎn)出高菌體蛋白飼料進(jìn)行菌種篩選[7-9]和對其生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化[10-15]。分別以熱帶假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、綠色木霉、黑曲霉為出發(fā)菌株對菠蘿皮渣生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)高菌體蛋白飼料進(jìn)行發(fā)酵篩選優(yōu)良菌種；以菠蘿皮渣為主要原料、豆粕和麩皮為輔料制備培養(yǎng)基，分別接入各出發(fā)菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)液，以發(fā)酵產(chǎn)物中的粗蛋白含量為考查指標(biāo)，先進(jìn)行單一菌種的篩選，再將得到的較優(yōu)菌株進(jìn)行混合使用，設(shè)計(jì)一定比例的接種量、料液比、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度4個因素對發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，以發(fā)酵產(chǎn)物的理化品質(zhì)及感官指標(biāo)來考查[16-18]，得到最優(yōu)的發(fā)酵工藝條件，為利用菠蘿皮渣高效生產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的高菌體蛋白飼料提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

新鮮菠蘿皮渣，湛江鷹峰食品有限公司提供，于85℃下烘干后粉碎備用，按以下配方做成固體發(fā)酵培養(yǎng)基：菠蘿皮渣（干粉） 70%，麩皮22%，硫酸銨[(NH4)2SO4]3%，尿素[CO(NH2)2]3%，KH2PO42%，料液比為1∶1（V/V）。

1.1.2 菌種

產(chǎn)朊假絲酵母、綠色木霉，廣東省微生物研究所菌種保藏中心提供。

熱帶假絲酵母、黑曲霉，廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 儀器與設(shè)備

高溫滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、鼓風(fēng)干燥機(jī)、無菌操作臺、半微式凱氏定氮儀等。

1.2 分析檢驗(yàn)方法

1.2.1 水分含量的測定

采用國標(biāo)GB 5009.3—2016常壓干燥法測定。

1.2.2 粗蛋白含量測定方法

采用國標(biāo)GB/T 6432—2018凱氏定氮方法測定。

1.2.3 干物質(zhì)得率及粗蛋白得率測定方法

在115℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中將發(fā)酵產(chǎn)物烘干后進(jìn)行稱質(zhì)量，通過計(jì)算依次得干物質(zhì)得率、測蛋白得率。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化

（1） 產(chǎn)朊假絲酵母活化。首次活化用0.1～0.2 mL的無菌水溶解凍干管中的凍干粉，接種到2支麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，于26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；然后將首次活化菌種在麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)接活化2次，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

（2） 綠色木霉活化。首次活化用0.1～0.2 mL的無菌水溶解凍干管中凍干粉，接種到2支馬鈴薯斜面培養(yǎng)基上，于26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d；然后將首次活化菌種在馬鈴薯瓊脂斜面培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)接活化2次，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

（3） 熱帶假絲酵母活化。挑取2～3環(huán)實(shí)驗(yàn)室4℃冰箱保存的熱帶假絲酵母接種到2支麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，于26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

（4） 黑曲霉活化。挑取2～3環(huán)實(shí)驗(yàn)室保存的黑曲霉接種到2支馬鈴薯斜面培養(yǎng)基上，于26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 菌種液體種子制備

（1） 產(chǎn)朊假絲酵母菌種液。挑取2環(huán)新鮮活化的產(chǎn)朊假絲酵母到50 mL麥芽汁液體培養(yǎng)基中，在28℃條件下以轉(zhuǎn)速140 r/min振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。

（2） 熱帶假絲酵母菌種液。挑取2環(huán)新鮮活化的熱帶假絲酵母到50 mL麥芽汁液體培養(yǎng)基中，在28℃條件下以轉(zhuǎn)速140 r/min振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。

（3） 綠色木霉菌種液。挑取2環(huán)新鮮活化的綠色木霉到50 mL馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，在28℃條件下以轉(zhuǎn)速140 r/min振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

（4） 黑曲霉菌種液。挑取2環(huán)新鮮活化的黑曲霉到50 mL馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，在28℃條件下以轉(zhuǎn)速140 r/min振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.3.3 固體發(fā)酵試驗(yàn)

將培養(yǎng)好的液體菌種按設(shè)計(jì)好的接種量接種到固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在一定的環(huán)境條件下進(jìn)行發(fā)酵。

1.4 單一菌種篩選

按照固體培養(yǎng)基質(zhì)量的10%分別接入產(chǎn)朊假絲酵母、綠色木霉、熱帶假絲酵母、黑曲霉的液體菌種液到固體培養(yǎng)基中，制成固體發(fā)酵培養(yǎng)物，每個試驗(yàn)樣品設(shè)置3個平行組，另外設(shè)置一個空白對照組。在28℃恒溫箱中培養(yǎng)，2種酵母菌培養(yǎng)物培養(yǎng)3 d，其余2種霉菌培養(yǎng)物培養(yǎng)4.5 d。培養(yǎng)結(jié)束后，在115℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干發(fā)酵產(chǎn)物，測定發(fā)酵固體培養(yǎng)物的干物質(zhì)得率、粗蛋白含量，計(jì)算粗蛋白得率后通過比較篩選得出蛋白質(zhì)產(chǎn)量最高的各菌種。

1.5 混合菌種對菠蘿皮渣生產(chǎn)飼料蛋白發(fā)酵工藝優(yōu)化

將篩選出的最優(yōu)單一菌種的菌種液按1∶1體積比混合，接種到固體發(fā)酵培養(yǎng)物中。設(shè)計(jì)以不同的接種量、發(fā)酵溫度、料液比、發(fā)酵時間4個單因素分別對發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1.5.1 接種量條件優(yōu)化

設(shè)置5個接種量梯度6%，8%，10%，12%，14%，其他條件菌保持一致：料液比為1∶1，溫度為28℃，發(fā)酵時間為72 h。每個處理設(shè)置3個平行組，設(shè)置一個空白對照組。以所測粗蛋白含量最高對應(yīng)的參數(shù)為主，以感官指標(biāo)最好對應(yīng)的參數(shù)為輔，選擇最佳的接種量。

1.5.2 料液比條件優(yōu)化

設(shè)置5個料液比梯度2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，其他條件保持一致：接種量為上述選出的最優(yōu)參數(shù)，溫度為28℃，發(fā)酵時間為72 h。每個處理設(shè)置3個平行組。以所測粗蛋白含量最高對應(yīng)的參數(shù)為主，以感官指標(biāo)最好對應(yīng)的參數(shù)為輔，選擇最佳的料液比。

1.5.3 發(fā)酵溫度條件優(yōu)化

設(shè)置5個溫度梯度26，28，30，32，34℃，其他條件保持一致：接種量及料液比為上述選出的最優(yōu)參數(shù)，發(fā)酵時間為72 h。每個處理設(shè)置3個平行組。以所測粗蛋白含量最高對應(yīng)的參數(shù)為主，以感官指標(biāo)最好對應(yīng)的參數(shù)為輔，選擇最佳的發(fā)酵溫度。

1.5.4 發(fā)酵時間條件優(yōu)化

設(shè)置5個溫度時間72，84，96，108，120 h其他條件保持一致：接種量、料液比、發(fā)酵溫度為上述選出的最優(yōu)參數(shù)。每個處理設(shè)置3個平行組。以所測粗蛋白含量最高對應(yīng)的參數(shù)為主，以感官指標(biāo)最好對應(yīng)的參數(shù)為輔，選擇最佳的發(fā)酵時間。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一菌種篩選結(jié)果

采用產(chǎn)朊假絲酵母、綠色木霉、熱帶假絲酵母、黑曲霉這4種菌進(jìn)行單一菌種篩選試驗(yàn)，測定4種單一菌種對應(yīng)的發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白含量、干物質(zhì)得率、粗蛋白得率。

單一菌種發(fā)酵產(chǎn)物的各指標(biāo)含量變化情況見表1。

表1 單一菌種發(fā)酵產(chǎn)物的各指標(biāo)含量變化情況

由表1可知，以產(chǎn)朊假絲酵母、綠色木霉、熱帶假絲酵母、黑曲霉4種單一菌種及空白對照組進(jìn)行固體發(fā)酵，每組設(shè)置3個平行組，表1中粗蛋白含量、干物質(zhì)得率、粗蛋白得率為3個平行組的平均值。2種酵母菌（產(chǎn)朊假絲酵母、熱帶假絲酵母）發(fā)酵產(chǎn)物各指標(biāo)情況對比結(jié)果表明，粗蛋白含量為產(chǎn)朊假絲酵母高于熱帶假絲酵母，干物質(zhì)得率為產(chǎn)朊假絲酵母低于熱帶假絲酵母，粗蛋白得率為產(chǎn)朊假絲酵母高于熱帶假絲酵母，因此生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)蛋白能力更強(qiáng)的酵母菌為產(chǎn)朊假絲酵母。2種霉菌（綠色木霉、黑曲霉）發(fā)酵產(chǎn)物各指標(biāo)情況對比結(jié)果表明，粗蛋白含量為綠色木霉高于黑曲霉，干物質(zhì)得率為綠色木霉低于黑曲霉，粗蛋白得率為綠色木霉高于黑曲霉，因此生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)蛋白能力更強(qiáng)的霉菌為綠色木霉。綜合4種菌及對照組的各指標(biāo)情況可見，粗蛋白含量最高的2種菌依次為綠色木霉、產(chǎn)朊假絲酵母，粗蛋白得率最高依次為綠色木霉、產(chǎn)朊假絲酵母。由測定結(jié)果可知，單一菌種發(fā)酵效果越好，物料中粗纖維、糖類物質(zhì)等被菌種利用轉(zhuǎn)換合成蛋白質(zhì)的程度越高。因?yàn)楫a(chǎn)物的粗蛋白含量越高，干物質(zhì)得率越低，最終的粗蛋白得率就越高。

根據(jù)上述綜合分析，綠色木霉為試驗(yàn)的最優(yōu)菌種，產(chǎn)朊假絲酵母次于綠色木霉，最終確定綠色木霉和產(chǎn)朊假絲酵母為試驗(yàn)4種單一菌種中的最優(yōu)菌種。

2.2 混合菌種對菠蘿皮渣生產(chǎn)飼料蛋白發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.2.1 接種量條件優(yōu)化結(jié)果

按表1結(jié)果選出2種菌種的最優(yōu)菌種分別為綠色木霉及產(chǎn)朊假絲酵母，將綠色木霉及產(chǎn)朊假絲酵母的菌種液按1∶1體積比混合備用。在料液比為1∶1，發(fā)酵溫度為28℃，發(fā)酵時間為72 h，綠色木霉和產(chǎn)朊假絲酵母按1∶1體積比，混合菌種液接種量分別為6%，8%，10%，12%，14%的條件下進(jìn)行菠蘿皮渣的固態(tài)發(fā)酵。

接種量條件優(yōu)化結(jié)果見圖1。

圖1 接種量條件優(yōu)化結(jié)果

隨著發(fā)酵時間的推移，菠蘿皮渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵后蛋白質(zhì)含量的高低與菌體接種量、固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的水分、溫度、發(fā)酵時間有著緊密聯(lián)系。在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基含水量、溫度和發(fā)酵時間一定的情況下，增大菌種接種量有利于提高菌體生長量，從而提高產(chǎn)品蛋白質(zhì)的含量。

由圖1可知，菌種接種量在6%時菠蘿皮渣發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量很少，在接種量為10%之前蛋白質(zhì)含量隨著菌種接種量的增加逐漸增加，當(dāng)菌種接種量達(dá)到10%左右時，菠蘿皮渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)含量達(dá)到了最高水平，繼續(xù)增加接種量，蛋白質(zhì)含量稍有下降但也趨于平穩(wěn)，高于10%菌種接種量的發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量沒有明顯增加，可能與菌種發(fā)酵過程中從菠蘿皮渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中獲取的營養(yǎng)成分有限有關(guān)。從試驗(yàn)結(jié)果及生產(chǎn)成本角度來看，在料液比1∶1，發(fā)酵溫度28℃，發(fā)酵時間72 h的條件下，產(chǎn)朊假絲酵母和綠色木霉按1∶1體積比混合菌種液，接種量10%為最佳的發(fā)酵條件。

2.2.2 料液比條件優(yōu)化結(jié)果

在綠色木霉和產(chǎn)朊假絲酵母1∶1體積比混合菌種液，接種量為10%，發(fā)酵溫度為28℃，發(fā)酵時間為 72 h，料液比分別以 2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4的條件下進(jìn)行菠蘿皮渣固態(tài)發(fā)酵。

料液比條件優(yōu)化結(jié)果見圖2。

圖2 料液比條件優(yōu)化結(jié)果

由圖2可知，菠蘿皮渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中水分含量對產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量有很大影響，水是微生物生長必需的生長條件。在料液比為1∶3之前，蛋白質(zhì)含量隨著水分含量的增加而增加，料液比在1∶3左右蛋白質(zhì)含量達(dá)到最高水平，料液比1∶3后可能由于水分含量增加對微生物的生長繁殖起抑制作用，從而使發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量下降。由此可見，在工藝生產(chǎn)過程中，從生產(chǎn)操作、節(jié)約成本角度出發(fā)，確定最佳的發(fā)酵料液比為1∶3。

2.2.3 發(fā)酵溫度條件優(yōu)化結(jié)果

在綠色木霉和產(chǎn)朊假絲酵母1∶1體積比混合菌種液，接種量為10%，料液比為1∶3，發(fā)酵時間為72 h，發(fā)酵溫度分別為26，28，30，32，34℃的條件下進(jìn)行菠蘿皮渣固態(tài)發(fā)酵。

發(fā)酵溫度條件優(yōu)化結(jié)果見圖3。

由圖3可知，發(fā)酵溫度對微生物的生長影響很大，26℃時發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量較低，微生物生長緩慢，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的利用率不高，隨著溫度的上升，產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量呈上升趨勢，當(dāng)發(fā)酵溫度達(dá)到30℃時產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量達(dá)到最高，繼續(xù)提高培養(yǎng)溫度發(fā)酵產(chǎn)物則蛋白含量降低，菌種的發(fā)酵效果降低，這與菌種的生長受到溫度抑制有關(guān)，溫度過高可導(dǎo)致微生物的死亡。由此可見，發(fā)酵溫度控制在30℃左右時發(fā)酵效果最佳。

2.2.4 發(fā)酵時間條件優(yōu)化結(jié)果

在綠色木霉和產(chǎn)朊假絲酵母1∶1體積比混合菌種液，接種量為10%，料液比為1∶3，發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時間分別為72，84，96，108，120 h的條件下進(jìn)行菠蘿皮渣固態(tài)發(fā)酵。

發(fā)酵時間條件優(yōu)化結(jié)果見圖4。

圖3 發(fā)酵溫度條件優(yōu)化結(jié)果

由圖4可知，隨著發(fā)酵時間的增加，產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量增加，當(dāng)發(fā)酵時間達(dá)到96 h時達(dá)到最大值，繼續(xù)增加發(fā)酵時間，蛋白質(zhì)含量略微下降且逐漸趨于平穩(wěn)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量下降的原因可能是菠蘿皮渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中可提供微生物生長需要的碳源及氮源消耗完了，使最終發(fā)酵產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)含量偏低，也可能是由于霉菌發(fā)酵時間延長后形成了大量孢子，造成了負(fù)面的影響，從而使蛋白質(zhì)含量的測定結(jié)果偏低。由此可見，發(fā)酵時間在96 h左右的發(fā)酵效果最佳。

2.3 品質(zhì)檢測

經(jīng)過最佳發(fā)酵條件（綠色木霉和產(chǎn)朊假絲酵母1∶1體積比混合菌種液，接種量為10%，料液比為1∶3，發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時間為96 h） 的發(fā)酵，將固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的產(chǎn)品進(jìn)行提取，通過物理和感官2個方面的測定，檢驗(yàn)其品質(zhì)。

發(fā)酵條件優(yōu)化前后發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量對比見圖5。

發(fā)酵條件優(yōu)化后，測定優(yōu)化后發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白含量——利用半微式凱氏定氮法測定其粗蛋白的含量為20.27%。由圖5可知，蛋白質(zhì)含量從發(fā)酵條件優(yōu)化前（沒有外加菌種，料液比為1∶1，發(fā)酵溫度為28℃，發(fā)酵時間為72 h）的4.05%提升到發(fā)酵條件優(yōu)化后的20.27%。

產(chǎn)朊假絲酵母單一菌種的發(fā)酵產(chǎn)物有酸味，氣味不太宜人；產(chǎn)朊假絲酵母單一菌種的發(fā)酵產(chǎn)物有類似啤酒的酒精清香，氣味宜人。綠色木霉和產(chǎn)朊假絲酵母種子液1∶1體積比混合發(fā)酵的產(chǎn)物氣味宜人，有菠蘿的芳香。

圖5 發(fā)酵條件優(yōu)化前后發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量對比

3 結(jié)論

（1）試驗(yàn)通過對熱帶假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、綠色木霉、黑曲霉4種菌種進(jìn)行單一菌種篩選，測定其粗蛋白含量、干物質(zhì)得率、粗蛋白得率并進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)綠色木霉和產(chǎn)朊假絲酵母為試驗(yàn)4種單一菌種中的2株最優(yōu)菌種。

（2）在單一菌種篩選試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，繼而進(jìn)行混合菌種對菠蘿皮渣生產(chǎn)飼料蛋白發(fā)酵工藝優(yōu)化的試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)綠色木霉和產(chǎn)朊假絲酵母1∶1體積比混合發(fā)酵菠蘿皮渣生產(chǎn)菌體蛋白飼料的最佳工藝條件為接種量10%，料液比1∶3，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時間96 h。

（3）經(jīng)過蛋白質(zhì)含量測定及感官品質(zhì)測定，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵條件優(yōu)化后產(chǎn)物的營養(yǎng)和感官都有極大提高，發(fā)酵條件優(yōu)化后菠蘿皮渣發(fā)酵的蛋白質(zhì)含量從4.05%提高到20.27%，可成為畜禽優(yōu)質(zhì)高菌體蛋白飼料。