皖北地區腌制菜中具高抗氧化能力乳酸菌的篩選

黃 煜，蔣家璇，張凱迪，姚沛琳

（宿州學院生物與食品工程學院，安徽宿州 234000）

0 引言

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB） 是可以利用碳水化合物產生大量乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌的總稱[1]。乳酸菌不僅可以提高營養價值，改善食品的風味，還可以提高食品保鮮和附加值，而且還具有特殊的生理活性。大量研究表明，乳酸菌可以降低血清膽固醇、控制內毒素、制造營養物質，從而對機體的營養狀態、生理功能、衰老過程等產生作用。由于乳酸菌具有諸多益生作用，人們對此加以重視并開發利用[2]。

氧化是肌膚衰老的最大威脅，還可引發心血管、關節炎、癌癥等疾病[3]。飲食不健康、日曬、環境污染、壓力等都可以讓機體內自由基泛濫，從而使肌膚產生各種氧化現象。抗氧化物質就是以低濃度存在就能有效抑制自由基的氧化反應的物質，其可以直接作用在自由基上，也可以間接消耗掉容易生成自由基的物質，防止發生進一步反應[4]。人體中的抗氧化物質一部分由自身合成，另外一部分由食物供給。乳酸菌作為一種研究較多的益生菌，能夠降低自由基的生成[5]，作為一種天然抗氧化劑具有較大的研究價值。

從皖北地區腌制咸菜（宿州農貿市場采購的腌制雪菜、豆角、白菜等）中分離出來的20株乳酸菌的基礎上，測定其菌體及無細胞提取物的羥自由基清除率、DPPH自由基清除率、還原能力、螯合亞鐵離子能力這4個抗氧化指標，比較它們之間抗氧化活性的差異，篩選出具有高抗氧化活性的菌株，為后續研究提供優良的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株

20株乳酸菌，從皖北地區采集的腌制菜中篩選得到。

1.1.2 培養基

MRS培養基：魚粉蛋白胨10 g/L，酵母粉5/L，牛肉浸膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，乙酸鈉5 g/L，檸檬酸氫二銨2 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，硫酸錳0.25 g/L，硫酸鎂0.58 g/L，吐溫-80 1 mL/L，于121℃下高壓蒸汽滅菌15 min。

1.1.3 主要試劑

焦性沒食子酸、七水合硫酸亞鐵、六水合三氯化鐵、六氰合鐵（III）酸鉀、水楊酸、DPPH試劑等，均購置于國藥集團。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的活化

20株乳酸菌菌株保存于含30%（V/V） 甘油的MRS培養基中，于-80℃下保存，使用前按2%（V/V） 接種量接于MRS液體培養基中，于37℃下培養20 h，連續活化2次[6]。

1.2.2 乳酸菌無細胞提取物的制備

參考Liu C等人[7]的方法，并稍作修改。收集活化后的乳酸菌（4℃，以轉速6 000 r/min離心10 min），用PBS清洗2次后，重懸于PBS中，超聲破碎。超聲破碎條件設置為：功率60 W，工作3 s停8 s，共15 min。將超聲后的破碎液以轉速12 000 r/min離心20 min后取其上清液，經過0.22 μm的濾膜過濾后得到無細胞提取物。

1.2.3 乳酸菌DPPH清除率的測定

取樣品1 mL，濃度0.2 mmol/L的DPPH-無水乙醇溶液1 mL，依次加入試管中，二者充分混勻后，于37℃的恒溫水浴鍋中反應1 h，隨后立即于波長517 nm處測定制品的吸光度值，該方法用蒸餾水做空白對照[8]。自由基清除率計算方法如下：

式中：A1——空白管的吸光度；

A2——樣品管的吸光度。

1.2.4 乳酸菌羥自由基清除能力的測定

1，10- 菲羅啉 2.5 mmol/L溶液、PBS（pH 值 7.4）和樣品溶液各加入1 mL，再加1 mL濃度2.5 mmol/L FeSO4溶液。充分混合后，加入1 mL濃度20 mmol/L的H2O2溶液。反應混合物在37℃水浴中保持1.5 h。離心收集的上層清液是以轉速6 000 r/min離心10 min，其波長為536 nm。同時，按照上述方法，用1 mL PBS代替混合物中1 mL的樣品溶液作為空白對照組，測定536 nm處的吸光度[9]。自由基清除率計算方法如下：

式中：A1——對照組在波長536 nm處測得的吸光度；

A2——樣品管在波長536 nm處測得的吸光度。

1.2.5 乳酸菌還原能力的測定

取樣品0.5 mL，加入1%鐵氰化鉀溶液0.5 mL后PBS（pH值6.6）。混合在50℃恒溫水浴20 min。從水浴中取出后，迅速在冰浴中冷卻。加入10%三氯乙酸溶液0.5 mL，混合離心，取上清液（以轉速3 000 r/min離心10 min）。取上清液1 mL，加入0.1%氯化鐵溶液1 mL，拌勻。10 min后，以鹽酸半胱氨酸為標準品，于波長700 nm處測定吸光度。同時，用蒸餾器代替混合物中的樣品于波長700 nm處測量水的吸光度[10]。吸光度越高，待測樣品的還原能力越強。

1.2.6 乳酸菌螯合亞鐵離子的測定方法

加入0.1 mL抗壞血酸、0.1 mL硫酸亞鐵和100 mL硫酸亞鐵。2 mol/L的氫氧化鈉溶液，在37℃恒溫水浴20 min后，三氯乙酸沉淀的蛋白質，以轉速4 000 r/min離心10 min，取上清液0.2 mL，添加0.1%的鄰菲羅啉2 mL反應10 min后，于510 nm處測量吸光度，OD值，同時做空白試驗（PBS）[11]。

式中：P0——PBS系統OD值；

P1——樣品系統的OD值。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌對DPPH自由基清除率的測定結果

乳酸菌對DPPH自由基清除率結果見表1。

DPPH自由基清除率的測定是一種使用很廣泛的評價和篩選抗氧化劑抗氧化能力的方法。DPPH清除率越大表明抗氧化能力越強[12]。試驗測定了20株乳酸菌的無細胞提取物對DPPH自由基的清除情況。20株菌株都表現出一定的DPPH自由基清除能力。總體而言，菌體細胞DPPH自由基清除率要比無細胞提取物強。其中，菌株4-1，3-3的無細胞提取物對DPPH自由基清除能力比較強，分別為61.24%，60.85%；菌株3-1，3-3的菌體細胞對DPPH自由基清除率較強，分別為56.98%，52.71%。

2.2 乳酸菌清除羥自由基能力的測定

表1 乳酸菌對DPPH自由基清除率結果

乳酸菌清除羥自由基能力結果見表2。

表2 乳酸菌清除羥自由基能力結果

羥基自由基是一種體內氧化能力較強的自由基，可對大分子造成損傷。因此，清除羥自由基的能力也是衡量抗氧化能力的重要指標[13]。研究測定了不同乳酸菌的無細胞提取物對羥基自由基的清除能力，各菌株均表現出一定的羥基自由基清除能力。總體看來，菌體和無細胞提取物清除羥自由基能力相差不大，其中菌株7-1和6-2的菌體對羥基自由基清除能力較強，分別為48.80%，47.06%；菌株7-1和5-3的無細胞提取物對羥基自由基清除能力較強，分別為50.93%，49.96%；菌株5-1的無細胞提取物對羥基自由基清除能力最低，為5.76%。

2.3 乳酸菌還原能力的測定

乳酸菌還原能力的測定結果見表3。

抗氧化能力與還原能力直接相關[14]，20株乳酸菌的菌體和無細胞提取物的還原能力測定結果均顯示乳酸菌具有一定的還原能力，無細胞提取物的還原能力相對于菌體的還原能力而言更強。其中，菌株1-2的菌體細胞的還原力相對較強，為0.233，而菌株6-2的菌體細胞最弱，為0.086；菌株3-5的無細胞提取物的還原能力較強，為0.248，而菌株3-1的還原能力最低，為0.035。

2.4 乳酸菌螯合亞鐵離子的測定

乳酸菌螯合亞鐵離子的結果見表4。

表3 乳酸菌還原能力的測定結果

表4 乳酸菌螯合亞鐵離子的結果

由表4可知，20株乳酸菌均具有一定的螯合亞鐵離子的能力，但是菌體細胞和無細胞提取物對亞鐵離子的螯合能力基本上差別不大。其中，菌株10-1的無細胞提取物螯合亞鐵離子能力最強，為65.56%，其次是6-2，為34.00%；菌株A-1的菌體細胞相對較好，為65.66%，而菌株4-1的則最差，為0.75%。

3 結論

乳酸菌的抗氧化作用與其對人體健康息息相關[15]。試驗以羥自由基清除率、DPPH自由基清除率、還原能力的測定、螯合亞鐵離子能力的測定為體外抗氧化能力評價指標，對20株分離于皖北地區不同腌制菜中的乳酸菌為篩選源，比較其菌體細胞和無細胞提取物的抗氧化活性。結果表明，20株菌株中，菌體細胞的DPPH自由基清除率要比無細胞提取物強要強，而清除羥自由基能力和螯合亞鐵離子能力兩者相差不大，無細胞提取物的還原能力相對于菌體細胞的更強。總體上，菌株7-1抗氧化能力較好。其中菌株7-1，3-3，A-1的菌體細胞抗氧化能力強，菌株3-1，3-5，10-1的無細胞提取物抗氧化能力強。在今后的研究中，可以對抗氧化能力強的乳酸菌采用細胞模型或動物模型，對其體內抗氧化能力進行評價。